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動物焦慮行為實驗手冊丨高架十字迷宮實驗測試方法、指標評價及注意事項


高架十字迷宮(Elevated Plus Maze, EPM)是一種在神經科學領域中被廣泛用于焦慮與其相關癥狀研究的行為實驗,此種實驗充分利用了嚙齒動物不喜歡開闊地并盡可能的去追求遮蔽的天性。高架十字迷宮為一個擁有四種選擇的迷宮,其中兩個方向為開闊且無圍墻保護的空間(Open Arms) ,而另外兩個為封閉空間(Close Arms) ,動物在天性驅使之下會去追求遮蔽,因此會在擁有遮蔽的封閉臂待上較久的時間,利用老鼠害怕開闊地的天性進而觀察其焦慮或恐懼所造成的行為。


高架十字迷宮實驗模式的雛型是由 KC Montgomery于 1955年所創立的,他使用了改裝過的Y字迷宮(Y-Maze) ,與現今的Y字迷宮不同的是他所使用的迷宮分別擁有一個開闊臂與封閉臂,動物馬上就會對這兩臂有著直接的喜好與厭惡而無需特定誘因 。基于這樣的結果,  Handley and Mithani  ( Handley & Mithani 1984 )在1984年研發出了高架十字迷宮,自此高架十字迷宮即成為了研究焦慮成因以及研發抗焦慮藥的利器。



高架十字迷宮硬體設備介紹 


標準的高架十字迷宮擁有一個小型的中間出發區域,此區域有4條向四方延伸的開闊/封閉臂,四條臂長約30-50公分且寬約為5-10公分,彼此間保持90度夾角,實際的大小由您要使用的實驗動物種類而定(大鼠、小鼠甚至是小型靈長目) 。開闊臂與封閉臂采交叉間隔,封閉臂通常擁有高達40公分但無天花板的墻面,墻面可以是透明或是霧面 ,至于開闊臂的末端建議可以加裝一塊擋板,防止動物在開闊臂探索時掉落。迷宮的顏色應該與實驗動物的顏色形成對比以利觀察或分析 (例如白鼠配深色迷宮) 。整組迷宮需離地至少50公分,防止動物從開闊臂逃離。

由于封閉臂的墻面可能會產生陰影,而陰影可能會影響動物本身的視野或行為,因此在架設高架十字迷宮時需特別考量燈光的位置,將燈源架設在迷宮的正上方會是個好選擇。使用軌跡追蹤系統(例如VisuTrack軟件,上海欣軟 )并架設攝影機時,也需要考量到攝影機是否能將整個迷宮映入畫面中且無陰影干擾。每只動物進行新的實驗前,務必徹底清理迷宮本體,避免上一個受測對象在現場留下了氣味等與實驗不相關的線索。 


另外還有一種紅外版本的高架十字迷宮,既可以杜絕燈光的復雜布置,也可以降低光線對實驗的影響,在實在迷宮底部鋪設十字狀紅外面板燈,使用定制的窄波帶寬的攝像機拍攝,這種方式基本上杜絕了陰影帶來的干擾,但是相對成本比標準的高架十字迷宮偏高,用戶可以根據經費預算酌情考慮。如需紅外版本的高架十字迷宮,可以聯系上海欣軟工程師,詳細咨詢!




實驗流程說明


高架十字迷宮用來評估焦慮以及焦慮癥狀。實驗鼠(不管是大鼠還是小鼠)天生都偏好封閉環境,待在封閉環境會帶給它們舒適與**感,因此正常個體在進行高架十字迷宮時都會主動避免開闊臂,即使是在探索階段動物也會避免暴露在開闊臂的環境之下過久。動物在接受了抗焦慮藥品后會產生焦慮行為減少的現象并且增加探索危險區域的頻率,另一方面,動物若接受的是促進焦慮現象的藥品,則會大大增加待在封閉臂的時間(即使是與正常的老鼠相比)  。計算動物花在兩種臂的時間比即為我們探討動物焦慮癥狀嚴重與否的重點所在。 


與許多需要適應甚至重覆訓練的迷宮不同,動物進行高架十字迷宮之前無需進行任何的適應或訓練,我們要得到的正好是動物在不熟悉環境下本能產生的反應,不過在進行每次實驗之前,迷宮都需要被徹底清潔并消除氣味,避免不相關的線索干擾實驗結果。


1、實驗之前,一定要確保高架十字迷宮整個裝置的清潔。這個步驟不僅僅是要求當天的**實驗,更加側重于每一次動物實驗完成后的清潔除味工作,一定要去除上一只動物在宮體內**下來的尿液、糞便等,盡可能創造一個清潔、無味道的理想試驗環境。同時,實驗員需要記錄動物的編號、日期、狀態等信息;實驗動物提前運送到行為學實驗室專用臨時籠架 ,適應環境至少3H左右, 減少動物緊張。

2、將實驗動物(大鼠或者小鼠)從飼養籠中取出,實驗動物盡量背向實驗員,將動物輕輕放在儀器宮體的中央區域,動物面向開臂,然后實驗員迅速安靜的離開;

3、打開VisuTrack動物行為分析軟件,設置好參數,跟蹤動物在高架十字迷宮儀器內的軌跡運動,自動計算指標,通常實驗時長為5min;

4、實驗結束后,取出實驗動物,放入飼養籠,做好實驗完成動物的標記信息,同時,用酒精和紙巾清潔迷宮。


改進型迷宮設置

高架O字迷宮 (Elevated Zero Maze)的概念與高架十字迷宮相似,不過并沒有中央區域與四個方位的設計,取而代之的是一個循環的O型走道,其中分為了2種不同的片段(開闊區與封閉區) , 此種迷宮消除了方位與臂的選擇,使得學者們更能專注在探討動物對開闊閉的喜好或厭惡。

實驗指標

1、進入開放臂次數(open arm entry,OE):進入到任一開放臂的次數,以動物的四肢均進入臂內為準或者以動物身體80%進入臂內為準。

2、開臂活動(open arm time,OT):動物四肢全部進入或者身體80%進入開臂內的持續時間,單位:秒。

3、進入閉臂次數(closed  arm  entry,CE):進入到任一閉臂的次數,以動物的四肢均進入臂內為準或者以動物身體80%進入臂內為準。

4、閉臂活動(closed arm time,CT):動物四肢全部進入或者身體80%進入閉臂內的持續時間,單位:秒。

5、向下探究次數(head-dipping):實驗動物置身于中央區域或者開臂時,一邊用前爪握住迷宮邊緣一邊把頭部和肩部伸出開臂的邊緣向迷宮下面探究的行為次數。

6、閉臂后腿直立次數(rearing):也叫閉臂支撐性站立,動物在閉臂前腿抬起以后腿支持身體直立的次數。

7、中央區域活動:中央區域指的是開臂和閉臂鏈接交叉的區域,實驗動物在這個區域內的活動路程和滯留時間。


注意事項


  • 高架十字迷宮通常被用來進行焦慮相關研究

  • 高架十字迷宮擁有對稱的開闊臂跟封閉臂,彼此以90度夾角

  • 主要記錄動物對于開闊臂與封閉臂的偏好相關數據

  • 較不焦慮(或是施以抗焦慮藥品)的動物會進行較多次的開闊臂探索,且較不易產生焦慮行為

  • 有焦慮癥狀(或是施以焦慮促進藥品)的動物會減少探索開闊臂的次數與頻率,且易產生焦慮行為并偏好待在封閉臂

  • 高架十字迷宮很適合使用者改裝并加入想研究的元素

  • 不同品系的動物對高架十字迷宮會有不同的反應,設計實驗時需特別注意

  • 經過多次的驗證,訓練階段會讓動物熟悉環境,大大降低實驗階段探索的頻率,動物很有可能在實驗一開始就躲在它熟悉的角落休息,因此在新的實驗流程中,進行高架十字迷宮實驗是不需要訓練的。



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