摘要: 目的 研究新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)在 ICR 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力評價(jià)中的應(yīng)用效果。方法 將 40 只 ICR 小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為 4 組，方雌組( 方形行為箱雌性小鼠組) 、方雄組、圓雌組和圓雄組。按照相同的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)流程，測定各組小鼠對物體的探索時(shí)間。結(jié)果 方雌組與方雄組，圓雌組與圓雄組比較，探索時(shí)間和對新物體的分辨比均無顯著性差異( P＞0. 05) 。方組( 方雌組+方雄組) 與圓組( 圓雌組+圓雄組)比較，對新物體的分辨比無顯著性差異( P＞0. 05) ，但圓組的總探索時(shí)間顯著長于方組( P＜0. 01) 。結(jié)論 進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)時(shí)，性別不影響小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的評價(jià)，選擇圓形行為箱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可更好地評價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

動(dòng)物的認(rèn)知功能需要通過對其學(xué)習(xí)記憶的情況 進(jìn)行評價(jià)，因此需要建立規(guī)范的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，從 而準(zhǔn)確判斷其學(xué)習(xí)記憶的情況。根據(jù)嚙齒類動(dòng)物具有喜 歡 探 索 陌 生事 物 的 天 性，Ennaceur 和 Delacour于 1988 年報(bào)道了一種非獎(jiǎng)賞性的、簡單的認(rèn)知記憶實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀挛矬w與新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)，用于檢測嚙齒類動(dòng)物的記憶能力。該模型根據(jù)動(dòng)物對見過的熟悉物體和沒有見過的新物體的探究時(shí)間的長短來評價(jià)被測試動(dòng)物的記憶能力，即當(dāng)被測試動(dòng)物未遺忘環(huán)境中見過的熟悉物體時(shí)，便會(huì)用更多的時(shí)間探究沒有見過的新物體; 當(dāng)被測試動(dòng)物遺忘了見過的熟悉物體，則動(dòng)物對環(huán)境中沒有見過的新物體和見過的熟悉物體的探究時(shí)間應(yīng)基本相同。與其它動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法相比，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)具有不需要外部推動(dòng)力，只需要適當(dāng)?shù)挠?xùn)練即可完成，且具有實(shí)驗(yàn)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的學(xué)者的關(guān)注。但由于新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)缺乏統(tǒng)一 的 實(shí) 驗(yàn) 標(biāo) 準(zhǔn)，使其應(yīng)用受到一定的限制。以往研究針對物體材質(zhì)、時(shí)間間隔等具體檢測條件進(jìn)行，但缺少對行為箱形狀的研究，為了進(jìn)一步規(guī)范該方法的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究針對新物體實(shí)驗(yàn)方法中的實(shí)驗(yàn)行為箱形狀對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行考察。

1、材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

健康 ICR 小鼠，8 周齡，40 只，雌雄各半，體質(zhì)量 24～26 g，購自長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任 公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證 號: SCXK ( 吉) -2011- 0004］。遵照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，將小鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，控制溫度在( 22±1) ℃，12 h 明暗循環(huán)，自由采食和飲水，預(yù)飼期 1 周。

1. 2 實(shí)驗(yàn)儀器

小鼠自主活動(dòng)儀和小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)箱。

1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

ICR 小鼠 40 只隨機(jī)分為 2 組，每組 20 只，雌雄各半，即方組( n = 20) 和圓組( n = 20) 。各組按性別再次隨機(jī)分為 2 組，即方雌組( n = 10) 、方雄組( n = 10) 、圓雌組( n = 10) 和圓雄組( n = 10) 。

1. 4 新物體實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前 5 d，實(shí)驗(yàn)人員每天將小鼠放到手上撫觸5 min，消除小鼠的緊張恐懼感。實(shí)驗(yàn)前，通過小鼠自主活動(dòng)儀篩選，剔除活動(dòng)異常的小鼠( 活動(dòng)過少、活動(dòng)過多、轉(zhuǎn)圈等) 。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，先將小鼠放到實(shí)驗(yàn)室，讓其適應(yīng)環(huán)境 1 h，然后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)包含三個(gè)階段( 圖 1) 。階段 1 ( T1) : 分別將小鼠單獨(dú)放入敞開的行為箱( 底邊長44 cm×44 cm 的方形行為箱或半徑為 25 cm 的圓形行為箱) 中，自由探索 5 min。探索完畢后將小鼠取出，放回飼養(yǎng)籠中。清理行為箱中小鼠的糞尿，75%酒精擦拭，消除異味。本階段在實(shí)驗(yàn)第yi天上午、下午分別進(jìn)行一次。階段 2( T2) : 分別在行為箱的兩個(gè)相對的區(qū)域中放入 2 個(gè)完全相同的物體( 物體 1 和 1’) ，再次將小鼠放入行為箱中探索 5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，徹底清理行為箱。本階段實(shí)驗(yàn)在第er天上午進(jìn)行。階段 3 ( T3) : 物體 1 不變( 舊物體) ，物體 1’更換為物體 2( 新物體) ，再次將小鼠放入行為箱中探索 5 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，徹底清理行為箱。本階段實(shí)驗(yàn)在第er天下午進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均在上午 8 點(diǎn)至下午 5 點(diǎn)之間進(jìn)行。

采用SuperMaze動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)記錄分析 T2 和 T3 中小鼠分別探索 2 個(gè)物體的時(shí)間，其中探索物體 1 的時(shí)間記為 F，探索物體 1’或 2 的時(shí)間記為 N，探索兩個(gè)物體的總時(shí)間記為 F+N，計(jì)算小鼠對物體 1’和 2 的分辨比( discrimination ratio，DR) ［DR = N/( N + F) ×100%］。探索定義為小鼠面朝物體，鼻子與該物體的距離≤2 cm。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 21. 0 for windows 統(tǒng)計(jì)軟件包分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差( x珋±s) 表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗(yàn); 組內(nèi)比較用配對 Student t 檢驗(yàn)。以 P＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、 結(jié)果

2. 1 小鼠性別對新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在 T2 階段，各行為箱中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對物體 1 和 1’的探究時(shí)間: ( 31. 16±16. 75) s，( 30. 97±16. 50) s; ( 30. 37± 15. 95) s，( 31. 73 ± 15. 10) s; ( 112. 33 ±48. 26) s，( 112. 50 ± 49. 76) s; ( 112. 61 ± 47. 93) s，

( 112. 32± 47. 10) s 基本相同( P ＞ 0. 05) ，在 T3 階段，各行為箱中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對物體 2 的探索時(shí)間顯著長于對物體 1 的探索時(shí)間( P＜0. 05) 見圖 2，但相同形狀的行為箱( 方形行為箱，圓形行為箱) 中不同性別小鼠對 2 號新物體的 DR 無顯著性差異 ( P＞ 0. 05)

2. 2 行為箱形狀對新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在 T2 階段，不同形狀行為箱中小鼠對兩物體在5 min 內(nèi) 探 索 時(shí) 間 ( 30. 76 ± 15. 93 ) s，( 31. 35 ± 15. 40) s; ( 112. 47 ± 46. 81) s，( 112. 41 ± 47. 16) s 的差異未達(dá)到顯著水平( P＞0．05) ; 在 T3 階段，小鼠對 2 號物體的探索時(shí)間顯著長于 1 號物體，但兩種形狀行為箱中小鼠對新物體的分辨比無顯著差異( P＞0．05) 見圖 4。T2、T3 兩階段中，圓形行為箱中小鼠對兩物體的探索總時(shí)間( 224. 88 ± 37. 05) s，( 229. 15±33. 38) s 顯著長于方形行為箱中小鼠對兩物體的總探索時(shí)間( 62. 11 ± 23. 30) s，( 65. 58 ± 22. 40) s( P＜0. 01)

3、討論

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是在模仿測試人類失憶癥的識(shí)別任務(wù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，評價(jià)的是嚙齒動(dòng)物對物體的識(shí)別記憶能力。該模型是建立在嚙齒動(dòng)物對新異物體的自發(fā)探索行為的基礎(chǔ)上，且該模型不像迷宮學(xué)習(xí)中必須剝奪動(dòng)物飲食或在避免水淹動(dòng)機(jī)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶，也不像被動(dòng)回避測試中給予動(dòng)物電擊等負(fù)性強(qiáng)化讓動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶。所以該模型Zui大的優(yōu)點(diǎn)就在于可以讓動(dòng)物在完全自然的狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測試，能夠更好地模擬人類和靈長類動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶行為。因此，該模型越來越多地用在評估藥wu對記憶的作用研究上。

在新物體實(shí)驗(yàn)方法的使用中，如何規(guī)范實(shí)驗(yàn)流程，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)成了實(shí)驗(yàn)的核心問題。本實(shí)驗(yàn)通過比較采用不同形狀的行為箱進(jìn)行新物體實(shí)驗(yàn)時(shí)結(jié)果的差異，推斷行為箱形狀對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)中，T2 階段的兩個(gè)物體完全相同，且對于小鼠來說均為首ci接觸，因此各組小鼠對物體的 DR 值均在 50%左右，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無位置偏愛異常發(fā)生，即實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對兩個(gè)不同位置上的相同物體興趣相同。T3 階段，小鼠對 2 號物體的探索時(shí)間顯著長于 1 號物體，說明實(shí)驗(yàn)中選用的新物體引起了小鼠的探索興趣，物體的選擇正確。

各行為箱中，雌雄小鼠對新物體的分辨比無差異，表明不同性別的實(shí)驗(yàn)小鼠對新物體的分辨程度相同，即性別不影響對新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在 T3 階段中，不同形狀的行為箱中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均能對新物體顯示出積極的探索興趣，分辯比相似，表明行為箱的形狀差異不影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對新物體識(shí)別行為。但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在兩種形狀的行為箱中的總探索時(shí)間存在差異，說明行為箱的形狀對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的活動(dòng)程度有一定的影響。這可能是由于方形行為箱的角落效應(yīng)造成的。

研究結(jié)果表明，雖然在兩種不同形狀的行為箱中進(jìn)行的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物對新物體識(shí)別結(jié)果無差異，但為了避免角落造成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)能力降低現(xiàn)象的發(fā)生，我們認(rèn)為采用圓形行為箱進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋鼫?zhǔn)確地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對新物體的識(shí)別能力。