中藥益腎平肝方對脫髓鞘模型小鼠社會交互行為的影響及作用靶點

【摘要】 目的 觀察中藥益腎平肝方對精神分裂癥的zhi療效果以及探究其作用的潛在靶標。方法 實驗動物采用成年雄性

C57BL/6 小鼠，6 周齡，實驗分為 3 組，每組 10 只: 對照組，cuprizone( CPZ) 模型組和益腎平肝方( Yishenpingganfang，YSPGF) zhi療組，實驗共進行 6 周。社會交互實驗以及組織采集在后一次給予中藥zhi療 24h 后進行。采用社會交互實驗以評價 YSPGF 對小鼠精神分裂癥樣行為的影響; 采用髓鞘特異性免yi組化和 Western blotting 觀察成熟少突膠質細胞及少突膠質細胞前體細胞的表達變化。結果 CPZ 模型組小鼠于第 3 周出現明顯體質量下降( P ＜ 0. 05) ，YSPGF zhi療組與 CPZ 模型組相比，體質量差異無統計學意義( P ＞ 0. 05) ; 社會交互實驗: Trial 1 實驗中: 對照組小鼠圍繞陌生小鼠 1 ( Stranger 1) 的時間明顯大于圍繞空杯子( Empty) 的時間( P ＜ 0. 001) 。YSPGF 組與對照組類似，圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時間差異有統計學意義( P ＜ 0. 01) 。但模型組小鼠圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時間之間差異無統計學意義( P ＞ 0. 05) 。Trial 2 實驗中: 對照組小鼠對新加入的 Stranger 2 較之已經熟悉的 Stranger 1 更加感興趣( P ＜ 0. 001) 第; 成熟少突膠質細胞特異性抗體髓鞘堿性蛋白 ( myelin basic protein，MBP) 免yi組織化學染色和 Western blotting 顯示: CPZ 模型組小鼠成熟膠質細胞/髓鞘在胼胝體有一定程度缺失，YSPGF 組與 CPZ 模型組相比，髓鞘脫失有所好轉。進一步實驗顯示: 少突膠質細胞前體細胞血小板源生長因子受體 α( platelet-derived growth factor receptoralpha，PDGFＲ-α) 在 CPZ 誘導脫髓鞘后有反應性增生。結論 中藥 YSPGF 可以改善 CPZ 誘導小鼠的社會退縮，改善少突膠質細胞/髓鞘結構的損害。

【關鍵詞】 精神分裂癥; 益腎平肝方; 少突膠質細胞; 雙環己酮草酰二腙; 社會交互

精神分裂癥是一種病因尚未完全闡明的復雜性的精神ji病，全球人口受累率達到 0. 5% ～ 1. 0%［1］，是導致殘疾的十種主要ji病之一，給家庭和社會帶來巨大的經濟負擔［2］。精神分裂癥發病有多種假說，包括多巴胺 D2 受體亢進假說及神經發育異常假說［3］。目前抗精神病**主要是基于多巴胺 D2 受體作為靶點發揮臨床zhi療效果，但是仍然有一部分患者無法臨床痊愈，因此從神經保護角度開發新的抗精神病**是精神**研究的重要方向之一［4］。益腎平肝方( Yishenpingganfang，YSPGF) ［5］ 是首都醫科大學附屬北京安定醫院中西醫結合團隊用于zhi療精神分裂癥前驅期的一個有效經驗方，其臨床研究結果表明，該中**劑對精神分裂癥前驅期的癥狀和認知損害有改善作用。它的主要成分有菊花、山茱萸、防風、何首烏等。從山茱萸［6］和何首烏［7］中提取的活性成分對神經有保護作用。cuprizone 模型［8］( CPZ 模型) 是基于神經發育假說的一種能夠誘導中qu神經系統少突膠質細胞丟失和脫髓鞘的精神分裂癥樣模型［9］。為此，本研究采用 CPZ 模型研究中藥益腎平肝方的藥理學作用機制［10］。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物

6 周齡的雄性 C57BL /6 小鼠，共 30 只，體質量( 20 ± 2) g。所有小鼠均由首都醫科大學實驗動物部提供，實驗動物許可證號: SCXK( 京) 2016 － 0011。實驗環境清潔，晝夜交替 12 h，正常飲食飼養 1 周以適應環境。本實驗通過首都醫科大學動物倫理委員會批準( 倫理批號: AEEI-2018 － 047) 。

1. 2 主要藥品及試劑

雙環己酮草酰二腙( cuprizone，CPZ) 和成熟少突膠質細胞特異性抗體髓鞘堿性蛋白抗體 ( Anti-MyelinBasic Protein，MBP 抗體) 購自美國 Sigma 公司; 少突膠質細胞前體細胞血小板源生長因子受體 α( plateletderived growth factor receptor-alpha，PDGFＲ-α) 抗體( PDGFＲ-α 抗 體，APA5 ) 購 自 美 國 Abcam 公 司。YSPGF 的各種單藥飲片購自北京同仁堂 ( 大柵欄店) ，在首都醫科大學宣武醫院熬制成浸膏。兔二步法檢測試劑盒和 DAB 顯示試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1. 3 主要儀器

社會交互實驗系統( 40 cm × 60 cm × 20 cm，由3 個連在一起的箱子構成，廂壁由透明有機玻璃制成) 購自上海欣軟信息科技有限公司。

2 結果

2. 1 YSPGF 對小鼠體質量及小鼠胼胝體髓鞘堿性蛋白( myelin basic protein，MBP) 表達的影響前 2 周，3 組小鼠體質量變化差異無統計學意義。但從第 3 周開始，模型組小鼠體質量明顯減低( P ＜0. 05) 。第 4 周體質量略微增加。模型組小鼠體質量變化與 YSPGF 組小鼠相比，差異無統計學意義( P ＞0. 05) ( 圖 1A) 。免yi組化分析結果( 圖 1B) 顯示，模型組小鼠胼胝體 MBP 表達明顯下降，說明本研究CPZ 模型的建立是成功的。給予 YSPGF 處理后該組小鼠 MBP 表達有一定提高，提示 YSPGF 對白質損傷具有保護作用。

2. 2 YSPGF 對 CPZ 小鼠社會交互的影響

Trial 1 實 驗 中: 對 照 組 小 鼠 圍 繞 陌 生 小 鼠 1( Stranger 1) 的時間明顯大于圍繞空杯子( Empty)的時間( P ＜ 0. 001 ) 。YSPGF 組與對照組類似，圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時間差異有統計學意義( P ＜ 0. 01 ) 。但 模 型 組 小 鼠 圍 繞 Stranger 1 與Empty 的時間之間差異無統計學意義( P ＞ 0. 05 )( 圖 2A) 。Trial 2 實驗中: 對照組小鼠對新加入的 Stranger 2 較之已經熟悉的 Stranger 1 更加感興趣( P ＜0. 001) ，與 對 照 組 不 同，模 型 組 小 鼠 并 沒 有 對Stranger 2 表現出好奇，表明其社會動力以及對新奇事物的探索能力下降; YSPGF 組小鼠與新的陌生小鼠 接 觸 時 間 與 模 型 組 相 比，明 顯 增 多，表 明YSPGF 對 CPZ 小鼠的社會交往能力以及對新生事物的探索能力均有改善( 圖 2B) 。

2. 3 YSPGF 對小鼠海馬 PDGFＲ-α 表達的影響

Western blotting 結果( 圖3) 顯示，PDGFＲ-α 經 CPZ誘導脫髓鞘后有反應性增生，給予 YSPGF 進行干預后，PDGFＲ-α 的代償性增生與模型組相比，呈減少趨勢，表明 YSPGF 對小鼠的少突膠質細胞損害有所改善。

3 討論

越來越多的證據［11-13］顯示，精神分裂癥中少突膠質細胞/髓鞘存在異常，其證據主要來源于影像學研究［11］、尸檢［12］以及基因學研究［13］。CPZ［14］是一種銅離子的螯合劑，第yi次對 CPZ 的描述可追溯到 1950年 Gustav Nilsson 的實驗［15-16］。研究［17］顯示: CPZ 選擇性損傷少突膠質細胞。給予不同時間的 CPZ 處理會誘導出不同的行為學改變。例如，給予小鼠 2 ～ 3周 CPZ 處理，小鼠會出現更多的攀爬行為，如果給予4 ～ 6 周 CPZ，則表現為社會功能退縮。本實驗中，在給予小鼠 4 周 CPZ 后，免yi組化結果顯示，CPZ 小鼠在 4 周后少突膠質細胞大面積凋亡，說明筆者的 CPZ小鼠模型是成功的。在本實驗中，筆者采用 CPZ 誘導精神分裂癥樣動物行為，采用中藥 YSPGF 對 CPZ 小鼠進行zhi療。本研究社會交互實驗結果顯示; 第yi輪實驗( Trial 1)中，對照組小鼠圍繞陌生小鼠 1 ( Stranger 1) 的時間明顯大于圍繞空杯子( Empty) 的時間，YSPGF 組與對照組類似，圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時間差異有統計學意義，但模型組小鼠圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時間之間差異無統計學意義，**輪實驗 ( Trial 2) 中，對照組小鼠對新加入的 Stranger 2 較之已經熟悉的Stranger 1 更加感興趣，與對照組不同，模型組小鼠并沒有對 Stranger 2 表現出好奇，表明其社會動力以及對新奇事物的探索能力下降; YSPGF 組社會互動行為較模型組有一定的改善; 社會交互實驗主要反映實驗動物的社會交往能力和對新事物的探索能力，在一定程度上模擬了精神分裂癥的陰性癥狀( 意志行為活動缺乏和情感平淡) ，實驗結果表明，給予 YSPGF 進行干預，CPZ 小鼠的社會交往能力和探索能力有所改善，提示 YSPGF 對精神分裂癥的陰性癥狀有一定的改善作用。本研究免yi組化結果顯示，模型組小鼠胼胝體MBP 表達明顯下降，Western blotting 結果顯示，少突膠質細胞前體細胞 PDGFＲ-α 在 CPZ 誘導脫髓鞘后有反應性增生，說明經 CPZ 處理后小鼠少突膠質細胞/髓鞘有一定程度的受損。而經 YSPGF 干預后，MBP表達增多和 PDGFＲ-α 減少，說明中**劑對少突膠質細胞/髓鞘的受損有一定改善作用，也提示了該chu方有一定神經保護作用，也部分解釋了 YSPGF 改善CPZ 小鼠社會交互受損的藥理學機制。YSPGF 中的山茱萸、何首烏含有神經保護作用的成分。多項研究［18-19］表明山茱萸中的山茱萸環烯醚萜苷［6］( cornel iridoid glycoside，CIG) 能改善局灶性腦缺血大鼠模型的神經功能缺損，抑制腦組織炎性反應和神經元凋亡，促進神經發生和血管新生; 并且可改善穹窿 － 海馬傘切斷模型大鼠學習記憶功能，增高腦組織神經營養因子含量和神經元存活［20］。何首烏中提取的主要活性成分———四羥芪葡萄糖苷 ( tetrahydroxystilbene glucoside，TSG) 具有明顯的神經保護作用，可以改善動物的記憶能力。這些研究結果間接支持了本研究所發現的 YSPGF 的神經保護作用。本研究只是用社會交互行為模型探討了 YSPGF對精神分裂癥的陰性癥狀的改善作用，今后應該增加其他行為模型觀察該方對精神分裂癥的多維zhi療效果，如用 Y 迷宮觀察該方對 CPZ 小鼠的工作記憶受損是否有改善作用，用 PPI 觀察該方對 CPZ 小鼠的感覺門控受損是否有改善作用。本研究只是從 MBP 和PDGFＲ-α 的表達探討了 YSPGF 的神經保護機制，今后應該從 NＲG1-ErBb4 信號通路以及氧化應激通路更進一步探討該方的神經保護作用。本研究只是用小樣本動物進行了單一行為學實驗，今后應該根據行為學的增多和作用機制的深度探討擴大樣本量。