摘要: 目的考察靈芝孢子油對慢性輕度不可預見刺激模型小鼠行為學影響及可能的神經生理機制。方法采用13 種不同慢性輕度不可預見刺激對雄性BALB/C 小鼠連續刺激建立小鼠抑郁模型。從第3 周開始連續灌胃給予3 個劑量的靈芝孢子油( 850、283、141. 5 mg·kg － 1 ) ，鹽酸氟西汀( 10 mg·kg － 1 ) 或空白溶媒( 植物油) 2 周后，測定各組小鼠行為學變化，同時采用反相高效液相色譜法( ＲP-HPLC) 測定海馬谷氨酸( GLU) 和γ-氨基丁酸( GABA) ，酶聯**法測定腦源性神經營養因子( BDNF)的含量。結果與模型組比較，靈芝孢子油能增加抑郁小鼠的體重、糖水偏好率和曠場實驗得分( P ＜ 0. 01) ，縮短懸尾實驗和強迫游泳實驗的不動時間( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01 ) ，明顯降低海馬GLU 的含量( P ＜ 0. 01) ，增加BDNF 含量( P ＜ 0. 01) ，但對GABA 含量無影響( P ＞ 0. 05) 。結論靈芝孢子油對抑郁模型小鼠表現出明顯的抗抑郁作用，其抗抑郁作用可能與其降低GLU 和增加BDNF 相關。
關鍵詞: 靈芝孢子油; 慢性輕度不可預見刺激; 谷氨酸; γ-氨基丁酸; 腦源性神經營養因子
抑郁癥( depression，DEP) 主要表現為情緒低落、行為遲緩和悲觀厭世等癥狀，嚴重者可發生**行為。據世界衛生組織預測，2020 年抑郁癥將成為僅次于心血管**的**大疾患。但用于**抑郁癥的**如三環類抗抑郁劑、單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺再攝取抑制劑等，均有不同程度的副作用，如嗜睡、視物模糊、高血壓、驚厥和**低下等。因此，尋找**、副作用小的抗憂郁藥越來越引起人們的重視。
靈芝孢子油( ganoderma spore oil，GSO) 是從靈芝孢子中提取的脂質活性物，含有靈芝孢子的主要有效成分如三萜類、核苷類及部分多糖類化合物等。沈志勇等研究鋁中毒小鼠發現，靈芝孢子油提高小鼠的學習記憶水平。但靈芝孢子油在抑郁方面的作用未見報道，本實驗目的是了解靈芝孢子油的抗抑郁作用及其可能神經生理學機制。
1 材料
藥用植物油( 江西金源天然香料有限公司，批號: 20150116) ; 靈芝孢子油軟膠囊( 金華壽仙谷藥業有限公司，批號: 20150201，0. 425 g) ，靈芝孢子油化學成分分析由本院天然**所提供: 總三萜含量19. 6%，不飽和脂肪酸占68. 42%; 鹽酸氟西汀( fluoxetine，FH，常州四藥制藥有限公司，批號:20150223) ; 實驗前用0. 9%氯化鈉注射液配成所需濃度的溶液。
谷氨酸( glutamic acid，GLU) 對照品( 中國藥品生物制品檢定研究院，批號: 140624-200805，純度為100. 0% ) ; γ-氨基丁酸( gamma-aminobutyricacid，GABA，美國Sigma 公司，純度≥99. 0% ，批號: BCBG4279V) ; 正亮氨酸對照品( norleucine，Nle，北京百靈威科技有限公司，純度: 98% ，批號: L960N22 ) ; 對照品均用甲醇-水( 50∶ 50) 溶解并稀釋至所需濃度。異硫氰酸苯酯( 美國Sigma 公司，批號: BCBB1912V) ; 腦源性神經營養因子( brain-derived neurotrophic factor，BDNF)測定試劑盒( 合肥博美生物科技有限責任公司，批號: 201505) 。
XＲ － XZ301 曠場實驗分析系統，高30 cm，內徑50 cm，被等分為面積相等的25 個等邊方格、SuperFst 強迫游泳實驗分析系統，規格為直徑為15 cm，高度為20 cm、SuperTst 高通量懸尾實驗分析系統( 上海欣軟信息科技有限公司) ;LC － 20AT 液相色譜系統( 包括自動進樣器、紫外檢測器和工作站) ( 日本島津) ; X － 22Ｒ Centrifuge型高速低溫離心機( 美國Beckman 公司) ;TOLED0320 酸度計( 瑞士Mettler 公司) ; IKA T10勻漿機( 德國IKA 公司) 。
2 方法
2. 1 實驗動物及分組
健康雄性BALB /C 小鼠60 只，20 ～ 22 g［上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號SCXK( 滬) 20120002］。平衡飲食3 d 后隨機分為: ①空白對照組( blank) : 不刺激，并ig 給予藥用植物油; ②模型組( chronic unpredictable mild stress，CUMS) : 13種慢性刺激制作慢性輕度不可預知刺激模型( CUMS) ，并ig 給予藥用植物油; ③ 高劑量組( CUMS + GSO-H) : CUMS，并ig 給予靈芝孢子油850mg·kg － 1·d － 1 ) ; ④中劑量組( CUMS + GSO-M) :
CUMS，并ig 給予靈芝孢子油283 mg·kg － 1·d － 1 ;⑤低劑量組( CUMS + GSO-L) : CUMS，并ig 給予靈芝孢子油141. 5 mg·kg － 1·d － 1 ; ⑥陽性對照組:CUMS，并ig 給予氟西汀10 mg·kg － 1·d － 1。均常規飲水，造模第3 周開始給藥，連續給藥14 d。**給藥劑量根據本實驗室前期實驗獲得。
2. 2 慢性輕度不可預見應激模型的建立本實驗采用Willer［5］抑郁模型方式造模。正
常組除外的5 組，每日給予不可預見應激刺激，包括18 h 食物剝奪、4 h 噪音、10 min 閃光、15min 熱刺激( 45 ℃) 、2 h 制動、5 min 冷凍( 4℃) 、15 min 搖晃( 頻率1 次·s － 1 ) 、18 h 濕籠( 100 mL 水) 、1 min 夾尾、16 h 飲水剝奪、5 min游泳( 25 ℃) 、20 次電擊( 30 V，30 s) 、24 h 異物，以上刺激每天隨機安排1 種，同種刺激在整個實驗周期中可出現多次，但不能連續出現，使動物不能預知刺激的發生，14 d 1 個循環，共造模28 d。每周測體質量1 次。
2. 3 曠場實驗( open field test，OFT)
在末次灌胃給藥1 h 后，每組取10 只動物，在室溫為25 ℃的安靜實驗室內將小鼠小心放在自發活動曠場箱底中心，觀察5 min 內活動情況。觀察指標為: ① 水平穿行方格數: 3 爪以上跨入鄰格或者重心落入; ② 豎直站立次數: 前肢離開水平地面1 cm 以上的次數。分別計算水平運動得分、垂直運動得分。每次做完實驗后清理箱內殘留物，**上1 只大鼠的氣味，以免影響下1只大鼠的行為。
2. 4 糖水偏好實驗( sucrose preference test，SPT)
實驗開始前，在安靜的房間內先訓練小鼠適應含糖飲水: 每籠同時放置2 個水瓶，第1 個24 h，2瓶均裝有1% 的蔗糖水; 第2 個24 h，一瓶裝有1%蔗糖水，另一瓶裝有蒸餾水。禁食禁水10 h 后，進行小鼠的蔗糖飲水實驗。同時給予每組小鼠事先定量好的1 瓶1% 蔗糖水，1瓶蒸餾水。1 h 后，取走2瓶水稱重，記錄每組的蔗糖水消耗量、蒸餾水消耗量以及總液體消耗量。于實驗的第7、14、21、28 天各測量1 次。蔗糖水偏好度( %) = ( 蔗糖水消耗量/總液體消耗量) × 100%。
2. 5 小鼠尾懸掛實驗( tails suspension test，TST)
于末次灌胃給藥l h 后，每組取10 只動物，在安靜無風的室內，將小鼠尾部距末端約2 cm 處，用醫用膠布粘貼固定在懸尾儀上，使小鼠呈倒掛狀態，兩側有黑色擋板隔開，遮擋小鼠視線，使其不受外界干擾懸掛6 min，記錄后4 min 內小鼠累計不動時間( 指小鼠停止掙扎，身體呈垂直倒懸狀態，靜止不動) 。
2. 6 強迫游泳實驗( forced swimming test，FST)
于末次灌胃給藥l h 后，每組取10 只動物，將小鼠單獨放入強迫游泳儀的圓柱形玻璃缸中，缸內水深10 cm，水溫( 25 ± 2) ℃，從小鼠入水后計時6min，記錄后4 min 內游泳累計不動時間( 指小鼠在水中停止掙扎，或顯示漂浮狀態，僅有微小的肢體運動以保持頭部浮在水面) 。每只動物做完后即換水。
2. 7 腦組織處理
冰浴下分離小鼠腦海馬，**稱重后1∶ 10 加入生理鹽水，冰浴下超聲裂解30 s; 在2 500 r·min － 14 ℃低溫離心30 min，取上清液0. 5 mL，加含100μmol·L － 1內標液2. 0% 高氯酸1 mL 混勻，14 000r·min － 1 4 ℃低溫離心30 min，取上清液作為樣品溶液。
2. 8 海馬腦源性神經營養因子含量測定
將海馬組織于4 ℃復溫，按1∶ 9 比例加入預冷50 mmol·L － 1醋酸緩沖液( pH 4. 75) ，勻漿后靜置5min，3 500 r·min － 1離心15 min，收集上清液作為樣品，按試劑盒說明測定。
2. 9 衍生劑配制及柱前衍生
衍生試劑為1 mol·L － 1 的三乙胺乙腈溶液: 取三乙胺139 μL，加乙腈861 μL，混勻; 0. 1 mol·L － 1異硫氰酸苯酯乙腈溶液: 取異硫氰酸苯酯12 μL，加乙腈988 μL，混勻。柱前衍生取氨基酸對照品溶液及樣品溶液200 μL，分別置1 mL 離心管中，加正亮氨酸內標溶液( 100 μmol · L － 1 ) 10 μL，加入1 mol·L － 1三乙胺乙腈溶液100 μL，0. 1 mol·L － 1異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1h，加入400 μL 正己烷，放置10 min，取下層溶液，用水稀釋10 倍，用0. 45 μm 濾器過濾，進樣10 μL;色譜條件: 色譜柱為Inertsil ODS-3 色譜柱( 4. 6mm × 250 mm，5 μm) ; 柱溫為40 ℃; 檢測波長為254 nm; 進樣量為10 μL; 流動相A 為0. 1 mol·L － 1醋酸鈉溶液( 用乙酸調節pH 為6. 5) -乙腈( 95∶ 5) ，流動相B 為乙腈-水( 80 ∶ 20) ，梯度洗脫程序0 ～ 2min，100% A; 2 ～ 15 min，100% →90% A; 15 ～ 25min，90% →70% A; 25 ～ 33 min，70% →55% A;33 ～ 43 min，0% A; 43 ～ 53 min，100% A。
2. 10 統計學處理
實驗數據以均數± 標準差表示。數據用孫瑞元DAS 軟件進行單因素方差分析后，再進行各組間均數兩兩比較分析，P ＜ 0. 05 表示差異有統計學意義。
3 結果
3. 1 靈芝孢子油對小鼠體重的影響與正常組比較，小鼠造模在第2 到3 周后體
重增加緩慢，第4 周甚至出現下降( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，說明小鼠在抑郁形成的過程中，可能影響消化系統功能，從而導致體重減輕。與模型組比較，陽性組和靈芝孢子油高劑量組小鼠的體重在3、4 周增加( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01 ) ，在4 周時，小鼠的體重也都得到明顯改善( P ＜ 0. 05 ) ，結果見表1。
3. 2 靈芝孢子油對蔗糖水偏好的影響
與正常組比較，模型組和各給藥組小鼠造模14d 其糖水偏好率降低( P ＜ 0. 05) ，模型組在第3、4 周其糖水偏好率降低更顯著( P ＜ 0. 01 或0. 05) 。但給藥組小鼠在28d，除低劑量組偏低外，高、中劑量組基本達到正常組水平。與模型組相比，各給藥組和陽性對照組小鼠14 d 差別沒有統計學顯著性，但在第3、4 周其糖水偏好率明顯增高( P ＜ 0. 01 或0. 05) ，高劑量組基本達到陽性對照組水平，結果見表2。
3. 3 靈芝孢子油在小鼠曠場實驗的得分情況
與正常組比較，模型組小鼠曠場實驗得分顯著性降低( P ＜ 0. 01) 。與模型組相比，高、中劑量組和陽性對照組小鼠敞箱實驗得分增加( P ＜ 0. 01 或P ＜ 0. 05) ，高劑量組基本達到陽性對照組水平。
3. 4 靈芝孢子油對小鼠懸尾實驗的不動時間的影響
與正常組比較，模型組小鼠懸尾實驗不動時間明顯延長( P ＜ 0. 01) 。與模型組相比，各給藥組和陽性對照組小鼠懸尾實驗不動時間縮短( P ＜ 0. 01或P ＜ 0. 05) 。結果見表3。
3. 5 靈芝孢子油對小鼠強迫游泳試驗不動時間的影響
與正常組比較，模型組小鼠強迫游泳試驗不動時間明顯延長( P ＜ 0. 01) 。與模型組相比，各給藥組和陽性對照組小鼠強迫游泳試驗不動時間縮短( P ＜ 0. 01) ，高、中劑量組基本達到正常水平，結果見表3。
3. 6 靈芝孢子油對小鼠海馬GLU、GABA 和BDNF的影響
與空白組比較，抑郁模型組大鼠海馬組織的GLU 含量升高，有明顯統計學差異( P ＜ 0. 05 ) ，BDNF 含量明顯降低( P ＜ 0. 01 ) ，GABA 含量變化不明顯( P ＞ 0. 05 ) 。與抑郁模型組比較，各給藥組和陽性對照組小鼠GLU 含量明顯降低( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05 ) ，BDNF 含量明顯升高( P ＜ 0. 01) ，高劑量組基本達到陽性對照組水平; 各給藥組和陽性對照組小鼠GABA 變化不明顯( P ＞ 0. 05) ，結果見表4。
4 討論
在本次實驗中，給予抑郁小鼠靈芝孢子油后發現，靈芝孢子油能增加抑郁小鼠的糖水偏好率和敞箱實驗得分，縮短TST 和FST 的不動時間，其效果與經典的抗抑郁藥鹽酸氟西汀類似。這個結果表明靈芝孢子油具有抗抑郁作用。
本次實驗中發現，模型組海馬GLU 含量明顯增加，BDNF 含量明顯降低，證實了GLU 和BDNF 在抑郁中的作用，這個結果與文獻報道基本一致，這說明抑郁的發生與神經***密切相關。同時分析了抑制性神經遞質GABA 含量的變化情況，在各實驗組均沒有發現有統計學差異，這個結果支持Petty的結論。
在給予抑郁小鼠靈芝孢子油后發現，靈芝孢子油能明顯降低海馬GLU 含量，增加BDNF 含量，這個結果說明靈芝孢子油可能通過降低腦內GLU 水平，從而降低興奮毒性，減少海馬神經元損傷。另外，靈芝孢子油增加BDNF 含量，促進神經元再生，保護神經元存活，有效防止發生神經退行性病變，從而降低抑郁的發生。關于靈芝孢子油影響GLU 和BDNF 的機制，我們分析了靈芝孢子油的化學成分，總三萜含量19. 6%，不飽和脂肪酸占68. 42%。三萜類化合物能夠減少腦內Glu。因而推測靈芝孢子油的降低海馬GLU 可能與其所含的三萜類化合物有關。長鏈多不飽和脂肪酸能促進神經祖細胞增殖。因而推測靈芝孢子油的增加BDNF 含量與其所含的多不飽和脂肪酸有關。
綜上所述，本實驗**證實了靈芝孢子油具有抗抑郁作用，其抗抑郁作用可能是其通過降低抑郁小鼠海馬GLU 水平和增加BDNF 水平來發揮作用。
