摘要:目的研究匹羅卡品(PILO)誘導(dǎo)的顳葉癲癇小鼠的恐懼記憶行為學(xué)變化規(guī)律，探討此行為學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)顳葉癲癇的可行性。方法建立PILO小鼠癲癇模型，分P ILO注射2 周組(n= 11). PILO注射6周組(n = 7)和PILO注射l0周組(n = 11），同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組(n = 10)。對(duì)各組小鼠進(jìn)行場(chǎng)景恐懼記憶實(shí)驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行海馬N issl染色觀察。結(jié)果經(jīng)過聲音提示恐懼記憶訓(xùn)練，小鼠恐懼記憶的獲得受到了損害。場(chǎng)景恐懼記憶測(cè)試發(fā)現(xiàn)PILO注射2周組小鼠的僵住時(shí)間與對(duì)照組無統(tǒng)訓(xùn)一學(xué)差異(P>0.05)，而6周組和10周組則顯示明顯的恐懼記憶減弱(P <0.05;聲音提示的恐懼記憶測(cè)試發(fā)現(xiàn)P ILO注射2周組和6周組小鼠僵住時(shí)間與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異((P > 0.05)，而10周組則出現(xiàn)明顯的恐懼記憶減弱((P< 0.05)。Nissl染色顯示，P ILO注射6周和10 周組小鼠海馬CA3的錐體細(xì)胞脫失，排列稀疏，間隙增大，許多細(xì)胞胞質(zhì)中的N issl小體減少或消失。結(jié)論P ILO誘導(dǎo)的顳葉癲癇小鼠恐懼記記憶的形成及場(chǎng)景恐懼記憶的回憶都受到了損害，但聲音提示的恐懼記憶得到了一定程度的保留。恐懼記憶行為學(xué)的變化可能會(huì)成為評(píng)價(jià)顳葉癲癇的一個(gè)臨床指標(biāo)。

    癲癇患者，特別是難治性顳葉癲癇患者的記憶功能常受到較為嚴(yán)重的損害。匹羅卡品引起的動(dòng)物癲癇樣發(fā)作在一定程度上反映了人類顳葉癲癇的特征，與人類癲癇發(fā)作有相似之處，包括發(fā)作時(shí)的腦電圖表現(xiàn)、發(fā)作的癲癇放電擴(kuò)散、海馬神經(jīng)元的缺失、苔鮮纖維出芽及齒狀回細(xì)胞彌散等，因此，其作為一種有效的顳葉癲癇模型廣泛應(yīng)用于難治性顳葉癲癇的研究。

    研究表明，情緒是由大腦的回路所控制的，這個(gè)回路是由前額皮層、杏仁核、海馬、前部扣帶回和腹中央紋狀體等腦區(qū)構(gòu)成。這些結(jié)構(gòu)整合加工情緒信息，產(chǎn)生情緒體驗(yàn)和行為，海馬和杏仁核在其中起關(guān)鍵的作用。研究表明，海馬是空間記憶的核心角色，而杏仁核在恐懼記憶中起重要的作用。由于P ILO顆葉癲癰小鼠的海馬和杏仁核都受到損傷，有理推測(cè)其恐懼記憶將受到損害。對(duì)于紅藻氨酸(IAA)點(diǎn)燃癲癰模型和杏仁核點(diǎn)燃癲癰模型，已有相關(guān)研究，但利用P ILO模型探討恐懼記憶行為與顳葉癲癇相關(guān)性的研究卻很少。本研究建立P ILO顆葉癲癰小鼠模型，在此基礎(chǔ)之上運(yùn)用場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，初步探索顳葉癲癇小鼠的恐懼記憶功能，探討利用場(chǎng)景恐懼測(cè)試評(píng)價(jià)顳葉癲癇的可行性。

1材料與方法

1.1動(dòng)物和試劑 清潔級(jí)雄性健康C57BL /6成年小鼠，7- 8周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXI（滬）2007 - 000使用許可證號(hào):SYXI（滬）2003 - 0020 PILO和阿托品購(gòu)自Sigma公司，地西伴購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司?？謶种萍s實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，貨號(hào)：XR-XC404，上海欣軟信息科技有限公司。

1.2癲癇模型的建立和分組先用阿托品(1 mg/kg)腹腔注射小鼠，以阻斷外周膽堿能作用;30min后腹腔注射P ILO ( 340 mg /k g)，注射后密切觀察動(dòng)物的癲癇性發(fā)作情況。致癇處理后按照R ac ine標(biāo)準(zhǔn)判定癲癰的發(fā)作程度，達(dá)到3-5級(jí)入選實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)3級(jí)均篩除。入選的動(dòng)物癲癇發(fā)作后，于出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)60 min后給予地西伴(l0mg/kg)腹腔注射，以抑制癲癰發(fā)作，減少動(dòng)物死亡。凡SE持續(xù)時(shí)間未達(dá)到60mn或中途死亡的動(dòng)物均篩除。共有32只小鼠成功建立模型，入選實(shí)驗(yàn)組，并進(jìn)一步分為PILO注射2周組(n= 11),PILO注射6周組(n= 7)和PILO注射10周組(n=11);另設(shè)正常對(duì)照組(n=10)。

1.3場(chǎng)景恐懼記憶實(shí)驗(yàn)

1.3.1實(shí)驗(yàn)裝置:在專用的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室里，采用一個(gè)獨(dú)立的隔離箱作為行為學(xué)測(cè)試的隔離大環(huán)境，里面安裝有 2W的白熾燈，同時(shí)有小排氣扇通風(fēng)。采用A, B兩個(gè)體積和形狀不同的箱子作為行為學(xué)測(cè)試的小環(huán)境。A箱為立方形，底部為不銹鋼欄，用于足部電刺激，頂部安裝有擴(kuò)音器，用于聲音刺激;B箱為圓筒形，為底部不帶不銹鋼欄的塑料箱。以A箱作為訓(xùn)練箱，于訓(xùn)練后1<將動(dòng)物放于其中，直接觸發(fā)場(chǎng)景恐懼記憶的回顧。B箱作為非應(yīng)激箱，將動(dòng)物置于其中，改變周圍的空間環(huán)境。每次實(shí)驗(yàn)前后都用酒精擦A, B兩箱，以免氣味影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)一。將動(dòng)物放在動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室的隔壁房間，每次取出1只動(dòng)物，放在一個(gè)相同的籠子里帶到動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在17 00 -19. 00之間進(jìn)行。

1.3.2聲音提示恐懼記憶訓(xùn)練:實(shí)驗(yàn)第1天，將動(dòng)物暴露在A箱里。適應(yīng)120 s后在第120, 180, 240, 300和360 s處分別給予持續(xù)30 s的白噪聲(75 dB)刺激，在每次白噪聲刺激*后2s同時(shí)給予持續(xù)2 s的足部電擊(0.2mA)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)400s,通過攝像頭觀察動(dòng)物的僵住(指動(dòng)物除了呼吸運(yùn)動(dòng)外，全身其他軀體運(yùn)動(dòng)全部停止的狀態(tài))時(shí)間。

1.3.3場(chǎng)景恐懼記憶測(cè)試:實(shí)驗(yàn)第2天，將動(dòng)物置于A箱120s不給任何聲音或電刺激。通過攝像頭觀察動(dòng)物的僵住時(shí)間。

1.3.4聲音提示的恐懼記憶測(cè)試:實(shí)驗(yàn)第3天，將動(dòng)物置于B箱。0-30s是適應(yīng)時(shí)間，第30s和90 s處給予持續(xù)30 s的白噪聲(75dB)刺激。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)150s通過攝像頭觀察動(dòng)物的僵住時(shí)間。

1.4   Nissl染色 各組隨機(jī)抓取3只小鼠進(jìn)行Nissl染色。打開胸腔，暴露心臟，用4%多聚甲醛依次通過心臟灌注后，斷頭取出完整腦組織，放入4%多聚甲醛中固定，然后移入30%蔗糖磷酸緩沖液中，4℃過夜。在冰凍切片機(jī)上切取30um厚的冠狀腦切片，進(jìn)行N issl染色形態(tài)學(xué)觀察。

1.5數(shù)據(jù)采集應(yīng)用superfcs軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)方差齊性與否分別采用參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。方差齊性資料的均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，非齊性資料用秩和檢驗(yàn)，P< 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2恐懼記憶行為測(cè)試結(jié)果

2.2.1聲音提示恐懼記憶訓(xùn)練:多數(shù)動(dòng)物的僵住行為于開始訓(xùn)練即出現(xiàn)，并隨訓(xùn)練次數(shù)的增加而明顯加重。在聲音提示恐懼記憶訓(xùn)練中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的僵住時(shí)間比例均隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升。從開始給予白噪聲(120 s)和足部刺激后，動(dòng)物開始出現(xiàn)僵住的動(dòng)作;240 s后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的僵住時(shí)間出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.01)，但各實(shí)驗(yàn)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)(圖1) o

2.2.2場(chǎng)景恐懼記憶測(cè)試:P ILO注射2周組小鼠的僵住時(shí)間與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);而PILO注射6周組和10周組小鼠的僵住時(shí)間明顯減少(P < 0.05)，但此兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)(圖2).

2.2.3聲音提示的恐懼記憶測(cè)試:P ILO注射2周組和6周組小鼠的僵住時(shí)間與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05);而PILO注射10周組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)(圖3) 2.3  N issl染色結(jié)果 對(duì)照組小鼠海馬結(jié)構(gòu)清晰，CA 3的錐體細(xì)胞排列整齊、密集，胞質(zhì)中N issl小體清晰可見(圖4A 1, 4A 2) . PILO注射2周組與對(duì)照組比較變化不大(圖4B1, 4B2)。PILO注射6周組小鼠海馬CA 3的錐體細(xì)胞脫失明顯，排列相對(duì)比較稀疏，細(xì)胞間隙增大，Nissl小體減少或消失，可見細(xì)胞空泡變性、核固縮濃染等(圖4C1, 4C2)。PILO注射10周組也同樣觀察到小鼠海馬CA3的錐體細(xì)胞脫失，排列稀疏，間隙增大，許多細(xì)胞胞質(zhì)中的N issl體減少或消失，也可見細(xì)胞空泡變性、核固縮、核碎裂等現(xiàn)象(圖4D1, 4D2)。

3討論

癲癇是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)**，其發(fā)病機(jī)制與腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)和抑制性氨基酸遞質(zhì)平衡失調(diào)有關(guān)。由于病例標(biāo)本獲取困難，目前癲癇的研究多數(shù)通過制作動(dòng)物模型來進(jìn)行。癲癇動(dòng)物模型的制作主要有化學(xué)誘導(dǎo)和電誘導(dǎo)兩種方式?；瘜W(xué)誘導(dǎo)簡(jiǎn)便易行，起效快。P ILO誘導(dǎo)的癲癇動(dòng)物模型是一種比較成熟的顳葉癲癇模型，在發(fā)作行為腦電圖、癇性放電擴(kuò)散等方面與人類的顳葉癲癇極為相似;其病理改變同人類顳葉癲癇的海馬細(xì)胞缺失、苔鮮纖維出芽等也極為類似;同時(shí)其發(fā)展的不同階段，包括急性損傷期、潛伏期、癲癇自發(fā)性發(fā)作的慢性期，也符合人類顳葉癲癇發(fā)生的特點(diǎn)，因此國(guó)際上將其廣泛用于顳葉癲癇的研究。

    足部電擊是一種能導(dǎo)致動(dòng)物恐懼的刺激，是研究動(dòng)物恐懼行為學(xué)的一種簡(jiǎn)便而敏感的方法。在本研究中，足部電擊是非條件刺激，A, B箱和白噪聲則是條件刺激，利用兩個(gè)不同的箱子對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的場(chǎng)景恐懼記憶進(jìn)行測(cè)試。在場(chǎng)景恐懼記憶測(cè)試(第2天)時(shí)，仍然使用訓(xùn)練的A箱是為了檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間提示的恐懼記憶的表現(xiàn);而在聲音提示恐懼記憶測(cè)試(第3天)時(shí)，把A箱變換為B箱，是為了改變環(huán)境，避免空間記憶干擾聲音提示的恐懼記憶的測(cè)試。

    本研究結(jié)果提示，在第3次足部刺激后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組僵住時(shí)間開始出現(xiàn)明顯差異(P< 0.01)，說明小鼠恐懼記憶的獲得出現(xiàn)了明顯的損害;而實(shí)驗(yàn)組之間未出現(xiàn)明顯差異，提示短時(shí)程恐懼記憶的形成在PD。致癇早期就受到一定程度的損傷，而且這種損傷并不隨癲癇發(fā)作時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。

    P ILO顳葉癲癇小鼠的海馬和杏仁核均受到了損傷。海馬一直以來被認(rèn)為與空間記憶的關(guān)系*為密切，許多研究均表明海馬的損傷會(huì)導(dǎo)致空間記憶受損;而杏仁核被認(rèn)為在恐懼記憶中起核心作用。本研究中，在第2天的場(chǎng)景恐懼記憶測(cè)試中，PILO注射2周組的小鼠沒有出現(xiàn)場(chǎng)景恐懼記憶的損害，而PILO注身寸6周組和10周組與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)，同時(shí)P ILO注射6周組和10周組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)，這可能表明小鼠在癲癇的慢性期出現(xiàn)了海馬的損傷，但并未因?yàn)橹掳B時(shí)間的增加而使場(chǎng)景恐懼記憶受到更加嚴(yán)重的損害。

    在杏仁核的刺激癲癇模型上發(fā)現(xiàn)了對(duì)場(chǎng)景恐懼記憶有損害，但對(duì)不連續(xù)的聲音刺激沒有損害。在本研究中，PILO注射2周組小鼠的聲音恐懼記憶也沒有受到損害，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(6周和10周)，聲音的恐懼記憶受到了一定程度的損害。此模型的組織病理學(xué)研究提示，隨著癲癇發(fā)作的時(shí)間增加，會(huì)出現(xiàn)損害杏仁核的情況。杏仁核在形成恐懼記憶的回路中扮演著重要的角色，因此它的損傷會(huì)導(dǎo)致恐懼記憶受到一定程度的損害。有研究表明杏仁核的損傷程度與恐懼記憶的損害程度沒有直接的相關(guān)性。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P ILO顳葉癲癇小鼠短時(shí)記憶和場(chǎng)景恐懼記憶受到了損害，但聲音恐懼記憶得到了一定程度的保留?？謶钟洃浶袨閷W(xué)的變化也許可以作為評(píng)價(jià)顳葉癲癇的一個(gè)指標(biāo)應(yīng)用于臨床。