SuperFcs條件性恐懼實驗方法案例以及注意事項

                                                ----毛冬青改善血管性癡呆小鼠學習記憶作用的研究

摘要：目的觀察毛冬青提取物（pubescent holly root extract，PHRE）對血管性癡呆（VD）模型小鼠學習記憶能力的影響，探討其潛在的作用機制。方法采用反復夾閉、再通雙側頸總動脈同時尾靜脈放血的方法制備小鼠癡呆模型，隨后將小鼠隨機分為假手術組，模型組，尼莫地平對照組（30 mg·kg-1），毛冬青低、中、高劑量組（5，10，20 g·kg-1），各組灌胃相應**10 mL·kg-1，連續35 d，從第30 天開始進行行為學檢測，末次給藥后收集大腦樣本，HE 染色觀察病理學變化、**組化法及Western Blot 法檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達。結果與假手術組比較，模型組小鼠的恐懼記憶時間明顯縮短，大腦海馬區神經元細胞病變嚴重，海馬區Bcl-2/Bax 蛋白表達的比值降低，且主要分布于胞質。與模型組比較，各**組小鼠的恐懼記憶時間明顯延長，大腦海馬區的組織病變情況改善，且海馬區Bcl-2/Bax 蛋白表達的比值顯著增加。結論毛冬青提取物可能通過上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax 蛋白表達，減少細胞凋亡，保護神經細胞，從而改善血管性癡呆小鼠的學習記憶功能。

關鍵詞：毛冬青提取物；血管性癡呆；學習記憶能力；細胞凋亡

隨著全球老齡化的出現，慢性**癡呆越來越引起人們的關注。其中，血管性癡呆（vasculardementia，VD）是繼阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）之后誘發老年期癡呆的**大病因，也是目前**可以預防的腦退化**類型。因此，研發有效預防及**VD 的**具有重要的意義。毛冬青為冬青科冬青屬植物毛冬青（Ilex pubescens Hook .et Arn）的干燥根或葉，是我國南方常用中藥，具有****、消腫止痛、****等功效，大量研究表明，毛冬青的各類制劑對冠心病、腦血栓、血栓性脈管炎等心腦血管**均有顯著療效。本研究通過觀察毛冬青提取物（pubescent holly root extract， PHRE）對血管性癡呆小鼠學習記憶、海馬區病理變化及凋亡相關蛋白表達的影響，探討毛冬青改善血管性癡呆學習記憶的可能作用機制，為中醫藥防治VD 提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物KM 種小鼠，雄性，SPF 級，體質量32～35 g，由廣東省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0002。實驗動物喂養環境：溫度23～25 ℃；相對濕度（50±5）%，常規飼料飼養。1.2 **及主要試劑毛冬青飲片分別購于康美藥業股份有限公司和廣州大翔藥業有限公司，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室黃海波教授鑒定為毛冬青植物Ilex pubescens Hook. et. Arn.。取毛冬青飲片300g，粉碎成粗粉，加入60 %乙醇加熱回流提取2 次，依次用6 倍量和4 倍量溶媒分別提取1.5 h 和1 h，濾過后合并藥液，減壓濃縮至150 mL，即得PHRE 儲備液，用時以蒸餾水稀釋至所需濃度。

尼莫地平片，拜耳醫藥保健有限公司，批號：BJ24208。SABC **組化染色試劑盒，博士德生物，批號： 11C29C。β-actin 抗體， bioworld， 批號：AP0060。Bcl-2 抗體，abcam，批號：ab182858。Bax抗體，abcam，批號：ab32503。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L），北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：IH-0011。

1.3儀器AUM220D 電子分析天平，日本Shimadzu公司；超低溫冰箱，美國Thermo 公司；制冰機，日本Sanyo 公司產品；高速冷凍離心機，中國中科中佳科技儀器有限公司； 多功能酶標儀， 美國PerkinElmer 公司；CM1950 冰凍切片機，ASP200S 脫水機，EG1160 包埋機，RM2135 切片機，ST5020 染色機，DC300 光學顯微鏡，均為德國Leica 公司；小鼠條件恐懼試箱、XR-XC404 條件性恐懼分析系統，上海欣軟科技有限公司。

1.4 分組、模型制備及給藥取雄性KM 種小鼠，采用頸總動脈結扎反復缺血再灌注的方法[5]制備經典VD 模型：小鼠腹腔注射3.5 %水合氯醛（10 mL·kg-1）全身麻醉，分離雙側頸總動脈，用動脈夾阻斷其血流30 min，松開動脈夾恢復血流10 min，重復3 次。于第1 次阻斷血流5 min 后， 小鼠斷尾放血約0.3 mL，冷凝止血。第3 次血流再灌注后30 min，觀察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可縫合皮膚。假手術組小鼠僅暴露雙側頸總動脈同等時間即可縫合皮膚。造模后第2 天，除假手術組外，將模型小鼠隨機分為5 組，分別為模型組，尼莫地平對照組（30 mg·kg-1），PHRE 低、中、高劑量組（含生藥量5，10，20 g·kg-1），每組12 只。各組小鼠按10 mL·kg-1灌胃給藥，連續35 d，每天1 次，假手術組及模型組灌胃等體積的蒸餾水。

1.5 行為學檢測

1.5.1爬桿實驗第30 天給藥后2 h，進行爬桿實驗測試。將一根長50 cm、粗1.5 cm 的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用紗布包裹以防打滑，小鼠頭朝下放置于竹竿頂部，記錄小鼠爬完桿長全長所需時間。正式記錄評分之前，訓練小鼠爬桿3 d，每日1 次，確保每只小鼠學會爬桿。根據爬桿時間進行評分，若小鼠墜落評7 分，不動評6 分，40 s 掉頭評5 分，20 s 掉頭評4 分，爬完全長31～40 s 者評3 分，21～30 s 者評2 分，11～20 s 者評1 分，0～11 s 者評0 分。

1.5.2條件恐懼實驗給藥34 d 后進行條件恐懼實驗，實驗分為兩個階段，**階段為恐懼訓練階段，即第34 天給藥2 h 后，將小鼠放入恐懼箱中，從20 s 開始給予聲刺激（75 dB，2000 Hz），持續10 s，從25 s 開始給予光刺激，持續5 s，從28 s 開始足部電刺激（0.8 mA）2 s。共進行4 個循環，間隔時間各為15 s。**階段為測試階段，即第35 天給藥2 h 后，將小鼠放入恐懼箱中，場景與受訓階段場景一致，提供相同的聲、光等提示性信號，但不給予電擊，動物仍將會表現出恐懼反應，通過觀察動物的僵直時間來反映動物對恐懼的記憶能力。

1.6樣本采集恐懼實驗結束2 h 后，每組隨機選取6 只小鼠，腹腔注射3.5 %水合氯醛（10 mL·kg-1）麻醉，通過心臟灌注4 %多聚甲醛固定腦組織，灌注完成后，取腦組織置于10 %中性福爾馬林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠斷頭處死，迅速摘取大腦，分離海馬區，用于**組化及Western Blot 檢測。

1.7 HE 染色觀察固定好的腦組織經修整、脫水、包埋、切片、HE 染色、封片等程序后，使用光學顯微鏡觀察小鼠海馬組織CA1 區組織結構的變化。1.8 **組化檢測Bcl-2、Bax蛋白的分布及表達用Tissue OCT-Freeze Medium 包埋小鼠大腦并制作冰凍切片。嚴格按照SABC **組化染色試劑盒說明依次固定、封閉、一抗孵育、二抗孵育、SABC 孵育、DAB 顯色、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察，并用數碼醫學圖像分析系統進行數碼照相及圖片分析Bcl-2、Bax 蛋白的分布及表達情況。

1.9 Western Blot 法檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達分離小鼠大腦海馬區組織，提取總蛋白，BCA 試劑盒進行定量。取50 μg 蛋白樣本，用15 %的聚丙烯酰氨凝膠進行電泳80 V、20 min，之后轉換為120V、80 min；然后采用濕轉法進行轉膜300 mA、1 h；TBST 洗膜10 min，3 次；5 % BSA 常溫封閉4 h；4 ℃孵育一抗過夜；TBST 洗膜10 min，3 次；37 ℃孵育二抗1 h；TBST 洗膜10 min，3 次；ECL 進行發光，用Image Lab 3.0 軟件對Western Blot 成像圖進行分析，計算各組蛋白與內參（β-actin）的相對表達值。1.10統計學處理方法采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，數據以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者使用LSD 檢驗；方差不齊者使用Dunnett’s 檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠爬桿評分比較爬桿實驗用于評價各組間小鼠肢體協調能力的差異。評分結果顯示：假手術組、模型組及各給藥組間均無明顯差異（P＞0.05），表明本研究采用的VD 造模方法對小鼠的運動及平衡能力沒有造成影響。

2.2 PHRE 對小鼠條件恐懼記憶的影響與假手術組比較，模型組小鼠的僵直時間百分比顯著縮短（P＜0.05），表明VD 模型復制成功，小鼠的記憶能力下降。與模型組比較，尼莫地平組及PHRE 中、高劑量組小鼠的僵直時間百分比明顯延長，差異具有統計學意義（P＜0.05），表明PHRE 在10~20 g·kg-1范圍內對VD 小鼠的記憶能力有明顯的改善作用。

2.3 毛冬青提取物對VD 小鼠大腦神經元細胞形態的影響病理組織學檢查顯示，假手術組小鼠大腦皮層和海馬區神經細胞的形態及分布未見異常。與假手術組比較，模型組小鼠神經細胞間質水腫，細胞核濃染、固縮，皮層神經細胞明顯減少，且伴有大量膠質細胞增生，多處聚集成堆，大腦海馬CA1 區的錐體細胞大量缺失、變性、壞死，齒狀回顆粒細胞變性成空泡樣。與模型組比較，PHRE 低、中、高劑量組和尼莫地平組小鼠的大腦神經元病變情況有明顯改善，體現為膠質細胞增生減少，海馬CA1 區錐體細胞病變程度明顯減輕。

2.4 **組化法檢測VD 小鼠海馬CA1 區凋亡蛋白Bcl-2、Bax的分布和表達結果顯示，Bcl-2 和Bax呈不連續的環狀或者片狀分布，主要在胞質表達。與假手術組比較，模型組的Bcl-2 和Bax 蛋白表達明顯增加。與模型組比較，尼莫地平組及PHRE 中、高劑量組的Bcl-2 表達增加，Bax 表達減少。表明VD 模型小鼠的海馬CA1 區神經元細胞發生凋亡，而在尼莫地平或PHRE 的干預下，凋亡現象減少，提示毛冬青提取物可以減少VD 模型小鼠的海馬CA1區神經元凋亡的發生。

2.5 Western Blot 法檢測VD 小鼠海馬區Bcl -2、Bax蛋白的表達Bcl-2 水平的升高和Bax 蛋白的降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強，是**起保護作用的標志。Bcl-2/Bax 的比值越大，則抗凋亡能力越強。結果顯示，與模型組比較，毛冬青提取物能提高VD 小鼠海馬區Bcl-2 蛋白的表達水平，同時降低Bax 蛋白的表達，即明顯升高Bcl-2/Bax 的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD 小鼠海馬區細胞的抗凋亡能力，從而對VD 小鼠海馬區的神經元起保護作用。

3 討論

本研究通過血流阻斷聯合放血法復制小鼠VD 模型，經過小鼠智能測試及病理學檢查證實模型制備成功。實驗結果表明，VD 模型組小鼠恐懼記憶時間縮短，且腦部海馬CA1 區神經元發生損傷，而毛冬青提取物能夠明顯提高VD 小鼠的恐懼記憶時間，降低VD 小鼠神經元細胞損傷的程度，結合其對凋亡蛋白Bcl-2/Bax 的影響可以推斷，毛冬青通過抑制海馬CA1 區的細胞凋亡而發揮神經保護作用。

大腦海馬區損傷會引起血管性癡呆，從而導致認知功能障礙。海馬體與大腦記憶有關，并且對腦缺血敏感[10]。大量實驗結果表明海馬CA1 區椎體神經元細胞的死亡會引起嚙齒類、靈長類動物以及人類出現認知功能障礙[11-12]。因此，海馬CA1 區錐體細胞對學習和記憶能力至關重要，然而CA1 區對腦缺血尤為敏感，會引起嚴重的學習和記憶功能退化。病理實驗結果表明，VD 模型組小鼠的大腦海馬CA1區錐體細胞大量缺失、變性、壞死，并且齒狀回顆粒細胞變性成空泡樣。毛冬青提取物可阻止CA1 區錐體細胞缺失，從而起到保護海馬區神經細胞，改善VD 小鼠學習記憶的作用。

細胞凋亡在缺血再灌注損傷中具有重要的作用。Bcl-2 和Bax 屬于Bcl-2 家族蛋白，調控細胞凋亡。Bcl-2 屬于抑凋亡蛋白，可以阻止細胞色素C從線粒體釋放到胞漿。Bax 屬于促凋亡蛋白，通過移位到線粒體膜上促進細胞凋亡，促進細胞色素C 的釋放。Bcl-2 通過平衡Bcl-2/Bax 維持線粒體結構穩定。結果表明，與假手術組比較，模型組小鼠海馬區Bcl-2 與Bax 蛋白表達均有所升高，可能為小鼠大腦間斷缺血后，促凋亡蛋白Bax 表達增加，誘導細胞凋亡，同時由于細胞自身的保護機制，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達反應性上調，發揮抑制凋亡的作用。由于Bcl-2/Bax 的比例決定細胞在受到凋亡信號刺激后是否發生凋亡，在VD 小鼠模型中，Bax 蛋白的表達占優勢，從而導致海馬區神經元細胞凋亡，海馬區形態受損，記憶力出現障礙；與模型組比較，毛冬青提取物能夠提高Bcl-2 的表達，降低Bax 的表達，從而顯著提高Bcl-2/Bax 的比值，使海馬CA1 區細胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通過調節海馬CA1 區Bcl-2、Bax 的表達，抑制CA1 區的細胞凋亡，從而改善VD 模型小鼠的學習記憶能力。

毛冬青已被廣泛應用于心血管系統**的**，療效確切。近年來，也有學者深入探討毛冬青對腦損傷的保護作用[14]。本實驗結果表明，毛冬青提取物在高劑量時，改善VD 小鼠學習記憶障礙的效果與尼莫地平相似，可通過抑制VD 模型小鼠的腦組織海馬區細胞凋亡來提高學習記憶能力，有望發展成為一種新的**血管性癡呆**。