曠場實驗箱、Morris水迷宮注意缺陷多動障礙大鼠模型的建造
【實驗目的】:探討曠場實驗箱、Morris水迷宮注意缺陷多動障礙大鼠模型的建造技術(shù)。
【方法】:將20只4周齡SD大鼠隨機分成模型組和對照組,模型組自由飲用0.2 mg/mL醋酸鉛溶液。28 d后運用開場實驗、Morris水迷宮、Lat迷宮觀察兩組大鼠行為學表現(xiàn);采用ICP一MS檢測大鼠血鉛濃度、酶聯(lián)**吸附測定法法(ELISA)測定大鼠血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量。
【結(jié)果】:模型組在開場實驗中大鼠穿越格子數(shù)、直立次數(shù)增多(P < 0. 05 ) ,Lat迷宮中直立次數(shù)及穿越角落的時間比例增加(P< 0. ,05),Morris水迷宮口標象限停留時間縮短(P <0.05);模型組大鼠血鉛濃度高于對照組(P < 0. 05 ) ,血清多巴胺和去甲腎上腺素含量低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。
【結(jié)論】:采用自由飲用0. 2 mg/mL醋酸鉛溶液法成功建造了ADHD大鼠模型,具有ADHD基本臨床特征,可做為ADHD的動物模型進行實驗研究。
【關鍵詞】:注意缺陷多動障礙模型;醋酸鉛;SD大鼠;行為學檢測;多巴胺;去甲腎上腺素
兒童注意缺陷多動障礙(ADHD)簡稱兒童多動癥,在兒童青少年精神心理**中具有代表性,其主要表現(xiàn)為自主活動增多、學習記憶能力下降、注意力不集中等。ADHD的病因和發(fā)病機制尚不確定,目前認為本病是由多種生物因素、心理和社會因素所致的一種綜合征。在ADHD的病因?qū)W調(diào)查中,外部環(huán)境因素對其影響占有絕大部分,特別是**生活環(huán)境和有害物質(zhì)的暴露,對正處于成長發(fā)育關鍵時期的青少年有巨大的影響。本文以少量鉛暴露建造ADHD大鼠模型,并從行為學和生化學兩個方而對其進行評估。
【1材料與方法】
1. 1實驗動物與分組20只SD大鼠,4周齡,雄性,SPF級(北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部),許可證號:SCXK(京)2011一0012。實驗室適應3d后,隨機分為A,B兩組(即模型組和對照組)。5只/籠(鼠籠25 cm x 45 cm x15 om),明暗交替比12: 12 h (7: 00一19 : 00),室溫2022 0C ,濕度適宜,大鼠自由進食和飲水。
1. 2實驗方法
1. 2. 1大鼠模型建造采用0. 2 mg/mL的醋酸鉛溶液自由飲用法建造模型,對照組自由飲用蒸餾水,余其同。
1.2.2行為學檢測
1. 2. 2. 1開場實驗:開場實驗視頻分析系統(tǒng)及開場實驗箱由上海欣軟信息科技有限公司提供。開場實驗箱由醫(yī)用有機板制成,規(guī)格為50 cm X 50 cm X 50 cm,采用九宮格為測試基底。測試前1d將大鼠放入開場箱10 min適應環(huán)境,以減少大鼠對陌生環(huán)境產(chǎn)生的焦慮而影響其活動水平,實驗開始時將大鼠輕輕放入中央格子,在光亮條件下,通過視頻分析系統(tǒng)自動記錄大鼠5 min內(nèi)的活動情況,記錄大鼠穿越的格子數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)以及糞便數(shù)。測試期間保持周邊光線和噪聲的一致性。
1.2.2.2 Morris水迷宮測試:Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)由上海欣軟信息科技有限公司提供,Morri s水迷宮箱體(箱體由直徑155 cm,高50 cm灰白色鐵皮圓形蓄水池及同顏色平臺構(gòu)成),池內(nèi)水深25 cm,水溫22-24 0C。將水池平均分為一、二、三、四四個象限,平臺頂端平面面積為8 cm X 8 cm,訓練期間迷宮外參照物的位置保持不變。將大鼠置于一個象限內(nèi),距圓心21 cm,距池壁20 cm,隱沒于水而下1.5 cm(訓練期間平臺位置不變)。第1d不設立平臺,讓大鼠進入水池自由游60 s進行適應性訓練。從第2d開始連續(xù)Sd隨機地從四個不同象限讓大鼠進入水中,大鼠入水尋找并逃避到平臺。
視頻分析軟件記錄大鼠從入水到找到平臺所需時間(潛伏期),若在120 s內(nèi)大鼠無法找到平臺,則由檢測者引導其上平臺。所有大鼠上臺后均停留10 s,以利于其對空間參照物的記憶。第6d去掉平臺,讓大鼠在水中游泳120 s,記錄大鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)、在原來平臺所在象限所停留的時間及路程,以此評價動物對己獲取信息的存儲、記憶能力。
1. 2. 2. 3 Lat迷宮:Lat迷宮實驗箱為一個40 cm x 60 cm x 60 cm的木箱,中間放置一個30 cmx 30 cm的透明有機玻璃箱,從而產(chǎn)生一個寬15 cm、長60 cm、高40 cm的通道,根據(jù)視頻分析軟件分析記錄觀察大鼠穿越角落的時間和直立次數(shù),作為對環(huán)境刺激的非選擇性注意水平的評價指標。
1.2.3生化指標測定
1. 2. 3. 1血鉛濃度的測定3. 0%****鈉腹腔注射麻醉大E (40 mg/kg),腹主動脈采l(TL 2. 5 mL于肝素抗凝管中待查;取2 mL全血于消解罐中,加8 mL濃硝酸冷消化1 h,按優(yōu)化程序進行微波消解,電熱板160℃趕酸后,用2. 0 %硝酸定容到25 mL,搖勻待測。采用電感藕合等離子體質(zhì)譜法(ICP一MS)測定全血中鉛含量。
1.2.3.2血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量測定3. 0%****鈉腹腔注射麻醉大鼠(40 mg / kg)后,腹主動脈采血4 mL于非抗凝管中,靜置3h,離心10 min (3 000rpm),取上清1 mL,分裝到兩個EP管中,于一80℃保存?zhèn)溆谩4笫笱逯卸喟桶泛腿ゼ啄I上腺素含量測定:采用北京利維寧生物科技有限公司提供的大鼠多巴胺和去甲腎上腺素酶聯(lián)**分析(ELISA)試劑盒。
1. 3統(tǒng)計方法采用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件,進行兩獨立樣本資料檢驗。
【2結(jié)果】
2. 1大鼠行為學指標檢測
2.1.1開場實驗結(jié)果比較模型組大鼠在開場試驗中表現(xiàn)大鼠活動能力的穿越格子數(shù)、直立次數(shù)較對照組大鼠增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P <0.05),而理毛次數(shù)和糞便數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。見表1
2.1.2 Morris水迷宮實驗結(jié)果比較模型組與對照組大鼠在連續(xù)Sd的定位航行實驗中找到平臺的時間(潛伏期)隨著實驗的進行逐日遞減,但是比較總體學習成績在兩組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P >0.05),見圖1;在第6d的探索實驗中,模型組大鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)與對照組沒有差異(P >0.05),但在目標象限停留的時間和游程比例較對照組大鼠縮短,差異具有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見表2
2. 1. 3 Lat迷宮實驗結(jié)果比較在Lat迷宮中,模型組大鼠總的直立次數(shù)及穿越角落的時間比例都高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見表3
2. 2生化學指標檢測與對照組相比,模型組大鼠血鉛濃度增加(P <0.05),且模型組大鼠血清中多巴胺和去甲腎上腺素的含量降低,差異有顯著性(尸<0.05)。見表4。
3討論
動物**模型主要用于實驗生理學、實驗病理學和實驗**學(包括新藥篩選)研究。**的發(fā)**展十分復雜,以人本身作為實驗對象探討**發(fā)生機制,對推動醫(yī)藥學的發(fā)展來之緩慢,且臨床經(jīng)驗的積累不僅在時間和空間上存在局限性,而且在道義和方法上也受到限
制。借助動物模型的間接研究,可以有意識地改變自然條件下不可能或不易排除的因素,更準確地觀察結(jié)果,方便、有效地認識人類**的發(fā)**展規(guī)律,研究防治措施。
適宜的動物模型,有助于ADHD的臨床干預**和實驗室基礎研究,闡明ADHD的發(fā)病機制和**的作用機理,同時也為ADHD**的預防干預探索新的思路。目前,關于ADHD動物模型的建立均以模仿ADHD的某一臨床表現(xiàn)為主要依據(jù),從遺傳、神經(jīng)發(fā)育及社會應激等多個層而建立模型。其中利用自然和人工培育的遺傳突變體構(gòu)建的SHR大鼠模型*為接近ADHD的表現(xiàn),能夠持續(xù)性的表達ADHD的一些基本特征,常被用于ADHD
的干預和**研究。其他的模型多是從ADHD的影響因素及發(fā)病機理來探討并建立,如尼古丁ADHD模型、社會隔離ADHD模型、基因缺失ADHD模型等。理想的ADHD動物模型應該具有:(1)模擬ADHD基本的臨床行為特征;(2)精神興奮劑****有效;(3)吻合臨床提出的一些合理的病理生理學假設;(4)對ADHD在行為、遺傳、神經(jīng)化學和**等方而研究提供預測作用;(5)能重復再現(xiàn),操作簡單,成功率高,能便于推廣應用。
鉛為環(huán)境中不可降解的有毒重金屬,一直被認為是ADHD的環(huán)境影響因素之一,流行病學研究己經(jīng)提供了有力證據(jù)表明即使在低濃度血鉛水平,生命早期鉛暴露會影響發(fā)育中的大腦。鉛暴露的兒童成年后智力下降,表現(xiàn)出認知缺陷。
本次研究中,采用自由飲用0. 2 mg/mL醋酸鉛溶液來復制大鼠ADHD模型,通過開場實驗、Morris水迷宮、Lat迷宮等行為學檢測,結(jié)合血鉛濃度、血清多巴胺和去甲腎上腺素含量變化等生化學指標對對動物模型進行評估。結(jié)果顯示:模型組大鼠血鉛含量明顯高于對照組,表明實驗中鉛染毒成功,是導致ADHD的**誘因。從行為學檢測指標來看,模型組大鼠在開場實驗中的直立次數(shù)、穿越格子數(shù)以及Lat迷宮實驗中直立次數(shù)、穿越角落停留時間較對照組增加,表明ADHD模型大鼠自發(fā)活動水平以及非選擇性注意水平增加,驗證了鉛暴露ADHD模型大鼠具備ADHD的多動和注意缺陷的臨床特點;Morris水迷宮實驗中模型大鼠在目標象限停留時間和游程所占時間比例較對照組大鼠明顯縮短,提示ADHD模型大鼠的記憶能力減退,進一步驗證了鉛暴露ADHD模型大鼠具備ADHD的臨床特點,該結(jié)論與Clements KM等的研究結(jié)果一致。由于ADHD的發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)密切相關,因此我們進一步檢測了大鼠的血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量,ADHD模型大鼠的血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量明顯低于對照組,表明鉛可降低體內(nèi)多巴胺和去甲腎上腺素水平,使得該模型更具ADHD的臨床特征。
本次實驗采用4周齡的SD大鼠作為實驗動物,是由于4周齡的大鼠相當于人類的兒童期,而大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與近似于人類,常被用做實驗室研究。采用自由飲用0.2 mg/mL醋酸鉛溶液來進行大鼠鉛染毒法制備ADHD模型,在一定程度上模擬兒童鉛污染過程。可見本實驗的擬ADHD大鼠模型建造成功,為今后兒童注意缺陷多動障礙的防治干預研究奠定了良好的實驗基礎。