摘要目的: 觀察穿梭實驗對血管性癡呆大鼠認知功能及腦組織血管緊張素含量的影響, 并與甲磺酸雙氫麥角毒堿作用效果進行比較。

方法: 實驗于 2005- 07 /11 在解放軍第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所七室完成。①選用清潔級 15～18 月齡 Wistar 大鼠 48 只, 雌雄不拘,體質量( 200±20) g。按隨機摸球法將 48 只大鼠分為 4 組: 假手術組、模型組、中藥組和西藥組(陽性對照組), 每組 12 只。除假手術組外( 進行假手術) , 其余組大鼠均采用改良 Pulsinellis 四血管阻斷法建立血管性癡呆模型。中藥組:以 0.45 g/( kg·d) 劑量灌胃步長腦心通混懸液, 由咸陽步長制藥有限公司生產,由黃芪、乳香、沒藥、全蝎、地龍等 16 味中藥組成, 0.4 g/粒; 西藥組: 以 0.32 mg/( kg·d) 劑量灌胃甲磺酸雙氫麥角毒堿混懸液, 該藥由瑞士山德士藥廠與天津華津制藥廠合作生產, 生產批號: 970141, 1 mg/片; 假手術組和模型組灌胃同容量生理鹽水; 每天分早、中、晚 3 次。術后當天開始用藥, 連續8 周。②于造模前, 造模后 2,4, 8 周進行穿梭箱檢查, 以主動回避反應比率表示大鼠的認知能力。于給藥結束后采用放射**分析法測定大鼠大腦皮質、下丘腦、海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量。③對數據進行單因素方差、均數間多重比較 q 檢驗; 數據間相關性處理采用直線相關分析。

結果: 造模過程中如有動物死亡則補充相應只數, *終進入結果分析的大鼠保持為 48 只。①主動回避反應比率: 模型組和中、西藥組大鼠術后2, 4, 8 周明顯低于假手術組(P < 0.01); 2 個**組均明顯高于模型組 (P< 0.01); 

兩**組間比較, 差異不明顯(P > 0.05)。②血管緊張素Ⅱ含量:模型組大鼠大腦皮質、下丘腦和海馬明顯高于假手術組(P < 0.01), 中、西藥組明顯低于模型組( P < 0.01) , 兩**組間差異不明顯 (P > 0.05)。③精氨酸加壓素含量: 模型組大鼠大腦皮質、下丘腦和海馬明顯低于假手 術 組 ( P < 0.01) ; 中 、西 藥 組 明 顯 高 于 模 型 組 ( P < 0.01) ; 中 藥 組大腦皮質、下丘腦明顯高于西藥組( P < 0.05) , 在海馬與西藥組相近( P > 0.05) 。④相關性分析結果: 假手術組、模型組、中藥組和西藥組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ含量與主動回避反應比率呈負相關(r=- 0.894, - 0.872,- 0.928, - 0.880, P < 0.05) , 而上述各組大鼠海馬精氨酸加壓素含量與主動回避反應比率呈顯著正相關( r=0.912, 0.892, 0.937, 0.897, P < 0.05) 。

結論: 步長腦心通改善血管性癡呆模型大鼠認知功能的作用可能是通過降低海馬等腦組織血管緊張素Ⅱ含量、提高精氨酸加壓素含量而實現, 作用效果與甲磺酸雙氫麥角毒堿相當。

主題詞: 癡呆, 血管性 /中藥療法; 血管緊張素Ⅱ; 精氨酸升壓素; 認知障礙; 認知

引言

步長腦心通是以《內經》“五臟藏神”理論為指導,具有****、化瘀通絡、醒腦開竅、宣痹止痛之功效的中成藥。本實驗旨在觀察步長腦心通對血管性癡呆模型大鼠認知功能及大腦皮質、下丘腦和海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量的影響, 為血管性癡呆尋求有效**手段, 探索中藥**血管性癡呆的確切藥理機制。

1 

材料和方法

設計: 完全隨機分組設計。

單位: 解放軍第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所神經內科。

材料: 實驗于 2005- 07 /11 在解放軍第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所七室( 國家重點實驗室) 完成。選用清潔級老齡( 15～18 月齡) Wistar 大鼠 48 只,雌雄不拘, 體質量( 200±20) g, 由解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所實驗動物中心提供 ( 許可證號: SCXK( 渝) 2003- 0003) 。按隨機摸球法將 48 只大鼠分為 4組: 假手術組、模型組、中藥組和陽性對照組, 每組 12 只。每籠 6 只, 大鼠自由覓食喝水, 在室溫(22±1) ℃、濕度

( 50±5) %環境下喂養。

**和試劑: 步長腦心通膠囊( 咸陽步長制藥有限公司, 國藥準字 Z20025001, 0.4 g/粒) , 由黃芪、乳香、沒藥、全蝎、地龍等 16 味中藥組成。以生理鹽水制成混懸液。喜得鎮( 瑞士山德士藥廠與天津華津制藥廠合作生產, 批準文號: (91)衛藥準字 X- 156 號, 1 mg/片, 生產批號: 970141) , 

用生理鹽水配成混懸液。血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素放射**分析法藥盒分別購自中國同位素公司北方試劑研究所和解放軍**軍醫大學神經生物學教研室。

設計、實施、評估者: 實驗設計為**作者, 干預實施為全部作者, 主動回避反應和腦組織血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量檢測為另二工作人員, 檢測者不知曉動物分組情況, 均受過專業培訓。

方法:

改良 Pulsinellis 四血管阻斷法制作血管性癡呆模型: 除假手術組外, 其余大鼠用 10 g/L 的****鈉腹腔注射麻醉, 大鼠取頸前部正中切口, 鈍性分離雙側頸總動脈, 穿 4 號線備用, 縫合頸部皮膚。然后取頸背部正中切口, 沿**頸椎翼小孔燒灼雙側椎動脈,阻斷血供 24 h 后, 再以微動脈夾反復夾閉雙側頸總動脈, 5 min /次, 間隔 1 h, 共 3 次。假手術組除不燒灼雙側椎動脈, 不夾閉雙側頸總動脈外, 其余處理同前。

給**法: 中藥組: 參照文獻以 0.45 g/( kg·d)劑量灌胃步長腦心通混懸液; 西藥組: 以 0.32 mg/(kg·d)劑量灌胃甲磺酸雙氫麥角毒堿混懸液; 假手術組和模型組灌胃同容量生理鹽水; 分早、中、晚 3 次。術后當天開始用藥, 連續8 周。

穿梭箱檢查: 采用上海欣軟信息科技有限公司提供的穿梭箱主動回避反應系統。該系統以聲、光為條件刺激。如大鼠在條件刺激后即能完成穿梭動作稱主動回避反應。大鼠的認知功能以完成主動回避反應的次數與測試總次數(20 

次)的比值即主動回避反應比率表示。術前大鼠行 7 d 的穿梭箱訓練, 以主動回避反應比率≥ 80%入選, < 80%

者淘汰;于術前, 術后 2, 4, 8 周行穿梭箱檢查。

標本采集、處理及儲存: 大鼠于給藥結束后在無麻醉下快速斷頭、取全腦, 置沸生理鹽水中煮 5 min 取出, 用濾紙吸干附著的液體后, 分離大腦皮質、下丘腦和海馬, 分別稱重后加入 1 mol /L HCl 1 m L, 勻漿后倒入塑料指形管中, 室溫放置 100 min, 再加入 1 mol /LNa OH 1 m L, 4 

℃, 4 000 r /min, 離心 10 min, 取上清液, 置- 70 ℃ 冰箱保存待測。

指標測定: 采用放射**分析法 測定血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量。操作嚴格按藥盒說明書進行,并根據標準曲線求得標本實際濃度。

主要觀察指標: ①造模前后各組大鼠主動回避反應比率差異。②給藥結束后各組大鼠不同腦區血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量比較。③給藥結束后各組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量與主動回避反應的相關性。

統計學分析: 計量結果采用 x±s 表示; 由**作者采用 SPSS 10.0 軟件對數據進行單因素方差、均數間多重比較q 檢驗; 數據間相關性處理采用直線相關分析。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析 納入大鼠 48 只, 造模過程中如有動物死亡則補充相應只數, *終進入結果分析的大鼠保持為 48 只。

2.2 各組大鼠穿梭箱檢查結果 見表 1。

2.3 給藥結束后各組大鼠大腦皮質、下丘腦和海馬血管緊張素Ⅱ含量比較 見表 2。

2.4 給藥結束后各組大鼠大腦皮質、下丘腦和海馬精氨酸加壓素含量比較 見表 3。 

2.5 各組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量與主動回避反應的相關性分析 假手術組、模型組、中藥組和西藥組大鼠海馬血管緊張素Ⅱ含量與主動回避反應比率呈負相關( r=- 0.894, - 0.872, - 0.928,- 0.880, P < 0.05) , 而各組精氨酸加壓素含量與主動回避 反 應 比 率 呈 顯 著 正 相 關 ( r =0.912, 0.892, 0.937,

0.897, P < 0.05) 。

3 討論

血管性癡呆是由于反復腦缺血導致與認知活動相關的海馬、皮質等結構不可逆的損害。從中醫辨證的角度來看, 系腎精虧虛、髓海失充、肝郁脾虛、痰阻血瘀、心脾虧損, 復因情志失調、勞作失度, 或他病累及而引發肝風, 風挾痰瘀, 血苑于上, 發為本病; 其中腎虛血瘀是關鍵。步長腦心通由黃芪、乳香、沒藥、全蝎、地龍等16 味中藥組成, 立法方義就是****、化瘀通絡, 且能扶正固本、攻補兼施、標本同治, 使瘀散血**暢, 心腦脈絡得以濡養, 可列為**血管性癡呆優選中成藥。

本實驗采用電腦控制的穿梭箱系統對各組大鼠進行行為學測試, 發現模型組大鼠造模后 2, 4, 8 周主動回避反應比率均明顯低于假手術組(P < 0.01); 中、西藥組雖明顯低于假手術組 P < 0.01), 但均明顯高于模型組(P < 0.01); 

兩**組間則無明顯差異(P > 0.05)。表明慢性腦灌注不足可引起大鼠認知功能損害, 而步長腦心通與西藥甲磺酸雙氫麥角毒堿療效相當, 對腦組織細胞起到修復營養作用, 并顯著改善血管性癡呆大鼠認知功能。

血管緊張素Ⅱ和精氨酸加壓素是具有生物活性的多肽, 不僅在血液中起著類似循環**的作用, 而且在**神經系統中發揮著神經遞質的作用, 參與腦的**神經功能, 與學習記憶密切相關。海馬及其周圍皮質是外顯記憶神經通路的重要組成部分。因此,在探討血管性癡呆發病機制、干預**、**篩選及評價中檢測不同腦區血管緊張素Ⅱ和精氨酸加壓素的含量變化, 近年來日益受到人們的關注。

除腎素- 血管緊張素系統外, 腦內存在局部腎素-血管緊張素系統。血管緊張素Ⅱ是腦內腎素- 血管緊張素系統的主要效應物質, 在下丘腦含量*高, 大腦皮質、邊緣系統含量也相當豐富。長時程增強是學習、記憶儲存的功能單位, 在海馬齒狀回 CA1 到 CA3 區均有習得性長時程增強的突觸應。Wayner 等發現將血管緊張素Ⅱ直接注入海馬背側, 可抑制長時程增強的產生; 如提前注入選擇性血管緊張素受體亞型 1的拮抗劑, 則可阻斷此反應。近年來又證實腦室注入血管緊張素Ⅳ或其受體激動劑可易化長時程增強, 顯著改善大鼠記憶的獲取、保留和再現。

本實驗結果表明, 模型組大鼠大腦皮質、下丘腦和海馬血管緊張素Ⅱ含量顯著高于假手術組(P < 0.01), 中、西藥組較模型組則有明顯下調趨勢( P < 0.01) 。揭示在血管性癡呆的發病中, 腦缺血、缺氧可能干擾了**腎素- 血管緊張素系統, 引起某些核團神經元及其交感神經活動增強, 導致腦內血管緊張素Ⅱ含量持續顯著升高,進而影響了認知功能; 同時表明步長腦心通與西藥組一樣可通過改善腦血液循環、保護腦組織, 使受損的神經元得以修復, 從而調節血管緊張素Ⅱ的分解、合成與釋放, 對血管性癡呆有顯著的改善作用。

大腦的邊緣系統尤其是海馬在信息整合、儲存和傳導過程中起著至關重要的作用, 對維持機體正常的學習記憶是不可缺少的。近年研究發現海馬 CA1區神經細胞的凋亡與丟失是血管性癡呆形成的病理學基礎。本實驗中, 慢性腦缺血、中西藥**使腦組織不同區域血管緊張素Ⅱ、精氨酸加壓素含量明顯降低或增多, 大鼠主動回避反應比率也出現相應顯著性改變, 其中海馬內神經遞質變化與主動回避反應比率尤 為 密 切 , 呈 顯 著 直 線 ( 正 或 負 ) 相 關 ; 揭示海馬的這些神經肽代謝對維持或改善學習記憶功能更為關鍵, 充分體現海馬在學習記憶功能方面的重要生物學意義。總之, 步長腦心通**血管性癡呆的機制可能是通過降低海馬等腦組織血管緊張素Ⅱ含量、提高精氨酸加壓素含量而實現, 但其確切機制有待進一步深入研究。