【摘要 】 目的 觀察補陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠學習記憶功能的影響 。 方法 33只 SD大鼠分成假手術組 ( n = 10) ,模型組 ( n = 11)和補陽還五湯組 ( n = 12) 。 線栓法誘導大鼠大腦中動脈阻塞模型 ,術前 7 d開始灌胃 (13. 3 g/kg) ,連續給藥 21 d, 1次 /d。 缺血后第 1～28天進行神經癥狀評分 ,第 30～35天采用八臂迷宮評價學習記憶功能 。 結果 缺血后第 32、34和 35天 ,補陽還五湯組大鼠總錯誤次數分別為(3. 21 ±0. 47)次 、 (1. 94 ±0. 59)次和 (1. 48 ±0. 51)次 ,參考記憶錯誤次數分別為 (2. 46 ±0. 52)次 、(1. 44 ±0. 53)次和 (1. 15 ±0. 57)次 ,與模型組比較差異有顯著性 ( P < 0. 05) ,但補陽還五湯對工作記憶錯誤次數沒有影響 ( P > 0. 05) ;補陽還五湯在缺血后 14 d內能顯著改善神經癥狀 ( P < 0. 05或 P < 0. 01) 。結論 補陽還五湯能顯著改善腦缺血恢復期大鼠學習記憶能力 。
【關鍵詞 】 局灶性腦缺血 ; 學習 ; 工作記憶 ; 參考記憶 ; 補陽還五湯；八臂迷宮實驗

補陽還五湯是臨床**腦缺血后遺癥的代表方劑 ,但目前有關補陽還五湯對腦缺血的實驗研究主要集中在急性期 。 本研究進一步觀察補陽還五湯對腦缺血恢復期學習記憶功能影響 。
材料與方法
一、材料
1. 動物 : SD 大鼠 ,雄性 ,浙江省實驗動物中心提供 ,體質量 250～300 g,二級動物 ,自由飲食進水 。
2.** :補陽還五湯**來源《 醫林改錯 》,黃芪120 g,當歸 6 g,川芎 4. 5 g,赤芍 4. 5 g,地龍 3 g,紅花3 g,桃仁 3 g,藥材購自浙江中醫學院附屬門診部并經鑒定。

3.儀器：八臂迷宮實驗裝置由上海欣軟信息科技有限公司提供。
二、方法
1. 線栓法誘導大鼠大腦中動脈阻塞模型 : 參照Longa等方法 ,大鼠用 100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg) 。 分離右側頸總、頸內和頸外動脈 ,從頸外動脈插栓線 (直徑約 0. 26mm)進入頸內動脈直至大腦中動脈 ,距頸總動脈分叉處約 18～20mm。 缺血 90m in后將栓線緩慢拔出 ,結扎頸外動脈。 術中用電熱板和白熾燈加溫 ,維持肛溫在 37℃左右 。 假手術組只分離血管 ,不插栓線。
2.分組與給藥 :采用完全隨機法將大鼠分成 3組。補陽還五湯組 ( n = 12) ,從術前 7 d開始灌服補陽還五湯 (13. 3 g/kg) ,持續到缺血后 14 d, 1次 /d。 假手術組 ( n = 10)和模型組 ( n = 11)灌服等量生理鹽水。
3. 神經癥狀缺失評分 :采用 Longa等評分標準 。
4.八臂迷宮檢測學習記憶能力 :參照 Chen等方法。 迷宮距地面高 50 cm , 中 間八 邊形平 臺直 徑24 cm,臂長 50 cm,寬 10 cm,高 50 cm。 在每個臂的頂端有一個強化用的食物杯 ,直徑 3 cm ,深 0. 5 cm。 在放迷宮的房間四周安放一些明顯的視覺標志。 在實驗開始和整個過程中限制進食 ,控制大鼠的體質量在自由飲食時的 80% ～85% ,自由飲水。 缺血后第 28、 29天適應。 第 1天將餌散放在迷宮的八個臂內和平臺上 ,每次放 2～3只大鼠 ,讓其自由進食 。 第 2天開始將餌只放在臂內 ,然后只放在食物杯內 ,使大鼠熟悉到杯內
尋找食物 。 缺血后 30～35 d進行學習獲得能力訓練 。在迷宮的其中四個臂 (1、2、4、7號臂 )放入餌。 實驗開始前將大鼠放在中央平臺 ,用一個不透明的塑料桶罩住 , 15 s后提起 ,讓大鼠在迷宮內自由活動 ,當大鼠將餌吃完或 5m in 后 ,實驗結束 。 每天訓練 4 次 ,連續6 d。 觀察指標 : (1)總錯誤次數 ,即大鼠進入沒有餌的臂 (包括已吃完和未放餌的臂 )的次數 ; (2)工作記憶錯誤次數 ,工作記憶錯誤是指大鼠再次進入開始放有餌的臂 ; (3)參考記憶錯誤次數 ,參考記憶錯誤是指大鼠第 1次進入沒有放餌的臂。
5. 統計學處理 :數據用 x ±s表示 ,采用 SPSS10. 0軟件進行非參數 Mann2 W hitney u檢驗。
結 果
一、補陽還五湯對腦缺血大鼠神經癥狀的影響補陽還五湯在缺血后 1～14 d能明顯改善神經癥狀。 其中在缺血后第 3, 5, 7天差異有非常顯著性 ( P< 0. 01) ,第 1, 14天差異有顯著性 ( P <0. 05) ,結果見表 1。
二、補陽還五湯對腦缺血大鼠學習記憶的影響
假手術組在訓練結束后已基本學會。 與模型組比較 ,補陽還五湯組在缺血后第 32, 34, 35天能顯著減少總錯誤次數和參考記憶錯誤次數 ( P < 0. 05) ,但對工作記憶錯誤次數沒有影響 ( P >0. 05) ,結果見表 2～ 表 4。

討 論
迄今為止 ,尚無一種普遍滿意的測試學習記憶的行為學模式 ,常用方法有 Y迷宮 、水迷宮等。 相對而言 ,八臂迷宮操作簡便 、可行 ,而且能區分短期的工作記憶和長期的參考記憶 ,現已被廣泛用于學習記憶功能評價 。
大腦中動脈阻塞后 ,缺血大鼠感覺運動和學習記憶能力明顯下降 ,這與 Ellsworth等報道一致。 我們根據預實驗結果 ,結合文獻報道 ,選擇給藥劑量13. 3 g/kg連續灌胃 21 d,發現補陽還五湯能顯著減少總錯誤次數和參考記憶錯誤次數 ,提高腦缺血大鼠的學習記憶能力。 由于大鼠腦缺血后神經癥狀恢復很快 ,補陽還五湯只在缺血后 14 d內能顯著改善神經癥狀 ,缺血后第 28 d,已基本無運動障礙 。
腦缺血導致行為學缺失和恢復的神經生物學機制還不清楚 。 急性期減少神經元死亡和恢復期促進神經再生都有助于神經功能恢復。 大鼠大腦中動脈阻塞后VD小鼠海馬 CA1區 CHAT及其 mRNA表達下降。 說明兩者水平降低與 VD 發病有關 ,至于其下降的可能原因 : ① 反復缺血 - 再灌注導致神經元凋亡 ; ② 前列腺凋亡反應 4 (p rostate apop tosis response24, Par24)具有降低 CHAT蛋白質水平、阻止細胞增加 CHAT活性的能力、激活 caspase家族半胱氨酸蛋白酶、誘導死亡基因的表達等作用 [ 5、 6 ] ,而 Par24在腦缺血后含量升高 。因此研究中 CHAT及其 mRNA 的下降可能與反復缺
血 - 再灌注使 Par24水平升高有關 。 ③CHAT受鈣調素激酶 Ⅱ 等蛋白激酶的磷酸化調節 ,這種磷酸化作用可以調節 CHAT的活性 。呂佩源等曾研究發現VD小鼠海馬神經細胞鈣調素激酶 Ⅱ的 mRNA 表達下降 ,因此 , CHAT及其 mRNA表達降低與鈣調素激酶 Ⅱ的 mRNA低表達有關。
石杉堿甲作為一種促智藥 ,傳統觀點認為其高效 、可逆抑制膽堿酯酶 ,進而改善癡呆者認知功能 。 現今認為其具有多重藥理作用。 首先它具有抗氧自由基 、抗細胞凋亡 、抗谷氨酸受體等神經保護作用 ,因此 ,該藥通過糾正海馬神經細胞缺血、缺氧狀態 ,改善了CHAT及其 mRNA的表達 ;其次 ,呂佩源等曾研究發現石杉堿甲能顯著改善 VD小鼠海馬鈣調素激酶 Ⅱ的mRNA的表達 ,增高的鈣調素激酶 Ⅱ通過其磷酸化作用 ,進一步增強了 CHAT的活性。
綜上所述 ,海馬神經元 CHAT及其 mRNA 的表達降低參與了 VD 的發病 ,石杉堿甲通過多靶點的藥理機制 ,提高了海馬兩者的表達 ,改善了 VD 小鼠海馬的膽堿能系統功能 ,進而提高了 VD 小鼠的學習、記憶成績。