【摘要】目的 探討minocycline抑制炎癥反應(yīng)對(duì)血管性抑郁小鼠行為及神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法 成年雄性CD1小鼠隨機(jī)分為3組，每組各10只，實(shí)驗(yàn)組造模后立即腹腔注minocycline每日1次連續(xù)7 d（30 mg/kg），對(duì)照組造模后給予同等劑量的生理鹽水，假手術(shù)組除不阻斷頸動(dòng)脈供血外，其余手術(shù)操作與實(shí)驗(yàn)組相同，術(shù)后同樣給予腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。術(shù)后第8天起行懸尾實(shí)驗(yàn)（第8天）、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（第9天）檢測(cè)抑郁行為，水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)（第10天）檢測(cè)認(rèn)知能力。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 CD1雄性小鼠30只，周齡10周，體重25～30 g（訂購(gòu)于**軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)），隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和假手術(shù)組，每組10只，造模前常規(guī)條件下飼養(yǎng)1周。

應(yīng)用前期實(shí)驗(yàn)中采用的反復(fù)缺血再灌注法進(jìn)行制備血管性抑郁小鼠模型。步驟如下：小鼠經(jīng)腹腔注射0.3%****麻醉成功后，取仰臥位，門(mén)齒及四肢固定，剪開(kāi)頸前皮膚及筋膜，在氣管兩側(cè)分別分離出左右頸動(dòng)脈，使用小號(hào)動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸動(dòng)脈供血5 min后，松開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)供血10 min，再次阻斷供血5 min后移除動(dòng)脈夾，術(shù)中密切觀察小鼠呼吸、心跳，術(shù)畢縫合皮膚，立即腹腔注射minocycline（30 mg/kg），對(duì)照組給予腹腔注射等劑量生理鹽水，恒溫板上復(fù)蘇，清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不阻斷頸動(dòng)脈供血外，其余手術(shù)操作與實(shí)驗(yàn)組相同。小鼠手術(shù)當(dāng)日定為術(shù)后第1天，術(shù)后第1～7天依照不同分組連續(xù)注射minocycline及生理鹽水每日一次，給藥完成后于術(shù)后第8天開(kāi)始行為學(xué)檢測(cè)。前期工作已發(fā)表模型組與假手術(shù)組行為學(xué)檢測(cè)的結(jié)果，在懸尾實(shí)驗(yàn)、暗箱實(shí)驗(yàn)等抑郁行為檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，模型組動(dòng)物較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯的抑郁行為，確定動(dòng)物模型成功。

1.2 行為學(xué)檢測(cè) 抑郁行為學(xué)檢測(cè)包括懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）、探洞曠場(chǎng)試驗(yàn)（open-field test）、認(rèn)知功能檢測(cè)為Morris水迷宮檢測(cè)。造模術(shù)后第8天開(kāi)始行為學(xué)測(cè)試。

TST檢測(cè)動(dòng)物的抑郁行為，基于Steru等之前建立的方法稍加改進(jìn)，采用上海欣軟信息科技有限公司的SuperTst小鼠懸尾系統(tǒng)，安排在術(shù)后第8天18∶00～22∶00進(jìn)行，距尾尖約1 cm處用膠布固定于懸尾系統(tǒng)測(cè)試箱的尾鉤上，小鼠頭部距地面約7.5 cm，關(guān)閉測(cè)試箱開(kāi)始計(jì)時(shí)，共觀察6 min，適應(yīng)2 min，設(shè)定軟件記錄后4 min的小鼠不動(dòng)時(shí)間。與假手術(shù)組的小鼠不動(dòng)時(shí)間相比較，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，可判定為小鼠出現(xiàn)抑郁行為。

探洞曠場(chǎng)試驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的抑郁行為，根據(jù)文獻(xiàn)中介紹的通用的小鼠分析方法。采用上海欣軟信息科技有限公司的Supermaze動(dòng)物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)于術(shù)后第9天進(jìn)行，將小鼠依次放入曠場(chǎng)測(cè)試箱（25 cm×25 cm×38 cm）中，測(cè)試箱底部有16個(gè)圓形小洞，放入小鼠后2 min開(kāi)始記錄，測(cè)試時(shí)間15 min，記錄探洞次數(shù)、活動(dòng)時(shí)間與總路程。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M小鼠較假手術(shù)組小鼠探洞次數(shù)減少、活動(dòng)時(shí)間縮短或總路程減少且差異有顯著性時(shí)，可判定為該組小鼠出現(xiàn)抑郁行為。血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

Morris水迷宮檢測(cè)動(dòng)物的認(rèn)知行為，按照文獻(xiàn)中對(duì)小鼠空間認(rèn)知檢測(cè)的方法進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用上海欣軟信息科技有限公司的Supermaze動(dòng)物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)水迷宮裝置，水池直徑120 cm，高50 cm，維持水溫21～22℃，第三象限放置平臺(tái)，平臺(tái)置于水面下1 cm，術(shù)后第10天開(kāi)始測(cè)試（第9天進(jìn)行訓(xùn)練，每只小鼠訓(xùn)練4次，每次120 s），隨機(jī)選擇4個(gè)象限作為入水點(diǎn)，將動(dòng)物面向池壁放入水中，同時(shí)開(kāi)始記錄小鼠入池至尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即潛伏期（latency），使其在平臺(tái)上停留20 s后取走，如小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)則將其引導(dǎo)上臺(tái)并停留20 s，記錄潛伏期為120 s，計(jì)算每只小鼠的平均潛伏期。

2 結(jié)果

2.1 minocycline對(duì)血管性抑郁小鼠抑郁行為及認(rèn)知能力的影響 懸尾實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及假手術(shù)組的小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間差異具有顯著性（F=6.59，P=0.005）（表2），SNK檢驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組懸尾不動(dòng)時(shí)間縮短，差異有顯著性，實(shí)驗(yàn)組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于假手術(shù)組，但兩組差異無(wú)顯著性；探洞曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及假手術(shù)組的小鼠探洞次數(shù)、活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)路程差異具有顯著性（F=6.17，P=0.008；F=11.55，P＜0.001；F=13.47，P＜0.001），SNK檢驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組探洞次數(shù)、活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)路程均增多，且差異有顯著性，實(shí)驗(yàn)組較假手術(shù)組的探洞次數(shù)增多、活動(dòng)時(shí)間減少，但兩組間差異無(wú)顯著性，實(shí)驗(yàn)組較假手術(shù)組小鼠活動(dòng)路程減少，且差異有顯著性。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，3組小鼠的潛伏期差異有顯著性（F=16.09，P＜0.001），SNK檢驗(yàn)顯示，與假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組潛伏期延長(zhǎng)，但兩組間相比潛伏期差異無(wú)顯著性。結(jié)果表明，經(jīng)給予minocycline**處理后，血管性抑郁小鼠的抑郁行為可得到改善，但其認(rèn)知能力卻無(wú)明顯改善。

2.2 minocycline對(duì)小鼠海馬組織腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6含量的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及假手術(shù)組小鼠海馬組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量差異均有顯著性（F=13.42，P＜0.001；F=18.69，P＜0.001；F=5.49，P=0.010），SNK檢驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組3種促炎性細(xì)胞因子均降低，差異有顯著性，實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬炎癥因子含量稍高于假手術(shù)組，但兩組差異無(wú)顯著性。結(jié)果顯示，minocycline對(duì)血管性抑郁小鼠海馬組織中3種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)均有抑制作用。

血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

2.3 minocycline對(duì)小鼠海馬組織5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量的影響 通過(guò)對(duì)前處理方法的優(yōu)化，*終選擇2%的HClO4生理鹽水溶解，以保證3種神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性，在此色譜條件下，3種神經(jīng)遞質(zhì)的色譜峰完全分離，保留時(shí)間分別為1.35 min，2.65 min，4.56 min，典型的色譜圖如圖2所示。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示，從結(jié)果看出3種化合物在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.9990。海馬組織勻漿中3種神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示，3組樣本中5-HT、DA的含量差異具有顯著性（F=4.17，P=0.026；F=5.18，P=0.012），NE的含量差異無(wú)顯著性（F=2.13，P=0.139）（圖3）。SNK檢驗(yàn)顯示，與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組和假手術(shù)組5-HT含量差異無(wú)顯著性，但假手術(shù)組5-HT含量高于對(duì)照組；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組DA含量增高，差異具有顯著性，但兩組間DA的含量差異無(wú)顯著性。結(jié)果表明，minocycline對(duì)血管性抑郁模型小鼠海馬中5-HT和NE無(wú)明顯影響，但DA含量增加血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用

3 討論

1997年Alexopoulos**提出“血管性抑郁”的概念，但腦血管**導(dǎo)致抑郁發(fā)生的機(jī)

制不明。Alexopoulos分析了一系列臨床研究后于2011年提出了血管性抑郁發(fā)病機(jī)制的“炎癥反應(yīng)假說(shuō)”，認(rèn)為年齡及腦血管病相關(guān)的炎癥過(guò)程介導(dǎo)了抑郁癥狀的發(fā)生。

薈萃分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的SSRI類(lèi)抗抑郁**可降低血清中TNF、IL-1β、IL-6水平，TNF-α拮抗劑依那西普和非甾體**藥塞來(lái)昔布對(duì)重癥抑郁患者的癥狀改善具有一定的**效果，但機(jī)制仍不明確。盡管****抑郁的研究取得一定進(jìn)展，但針對(duì)血管性抑郁的**干預(yù)研究仍然較少。

**代半合成四環(huán)素類(lèi)**minocycline可快速通過(guò)血腦屏障，抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，其**作用主要通過(guò)直接和間接地抑制**神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖，進(jìn)而減少TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的釋放表達(dá)。而前述的炎癥反應(yīng)抑制劑依那西普、塞來(lái)昔布僅針對(duì)部分炎性細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行抑制，非特異性**作用不如minocycline**有效。本研究首先觀察了給藥后海馬組織勻漿中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量，結(jié)果顯示給藥組3種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)明顯減少，表明minocycline可以顯著抑制血管性抑郁小鼠海馬中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

本研究采用前期研究中使用過(guò)的血管性抑郁小鼠模型，模擬缺血低灌注損傷所致的血管性抑郁，在前期工作中，本課題組在抑郁行為檢測(cè)中觀察到該模型小鼠較假手術(shù)小鼠具有明顯的抑郁行為且不伴有神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能缺損，同時(shí)在腦組織中觀察到以少突膠質(zhì)細(xì)胞減少為特征的腦白質(zhì)損傷（white matter lesions，WMLs）。而Sneed等研究證實(shí)皮層下深部白質(zhì)損傷是血管性抑郁特征性的神經(jīng)病理學(xué)改變，同時(shí)也是血管性抑郁作為老年遲發(fā)性抑郁一種亞型的依據(jù)。因此，該模型能夠有效地模擬血管性抑郁的病理生理狀態(tài)，是研究血管性抑郁的可靠模型。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)連續(xù)給予minocycline抑制炎癥反應(yīng)后，實(shí)驗(yàn)組小鼠抑郁行為較對(duì)照組明顯改善，進(jìn)一步驗(yàn)證了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子在血管性抑郁發(fā)生中的重要作用。

本研究的不足在于，由于用藥時(shí)間較短，****對(duì)動(dòng)物的認(rèn)知恢復(fù)未觀察到明顯的效果，仍然不能說(shuō)明****對(duì)認(rèn)知改善無(wú)效。目前針對(duì)認(rèn)知障礙前期——即可逆期的研究成為熱點(diǎn)，本研究將進(jìn)一步進(jìn)行長(zhǎng)程給藥與預(yù)防性給藥對(duì)認(rèn)知功能的影響，為臨床防治血管性認(rèn)知障礙提供依據(jù)血管性抑郁小鼠抑郁行為(懸尾實(shí)驗(yàn))及神經(jīng)遞質(zhì)的作用。