摘 要：目的：利用焦慮動物模型研究桑葉抗焦慮作用及其物質基礎。方法：將小鼠隨機分為空白對照組（蒸餾水 0.375 mL）、地泮對照組（0.0023 g/kg）、桑葉組（4.5 g/kg）、真空處理桑葉組（4.5 g/kg），每組 10只，雌雄各半，灌胃給藥，1 次/d，連續灌胃 4 d 后，依次采用自主活動儀、明暗箱、高架十字迷宮考察**對小鼠的行為影響；高效液相色譜法（HPLC）檢測行為學實驗后小鼠腦神經遞質含量。結果：與空白對照組比較，真空處理桑葉組可顯著增加小鼠在明箱停留時間（P<0.05），并顯著提高小鼠開臂滯留時間百分比（OT％）（P<0.05）。小鼠腦內神經遞質檢測顯示，真空處理桑葉組、桑葉組均可顯著降低小鼠腦組織 5-羥色胺（5-HT）濃度（P<0.05），去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）濃度也有降低，但無統計學差異。結論：桑葉具有抗焦慮作用，且其物質基礎可能為 γ-氨基丁酸（GABA）。

關鍵詞：桑葉；抗焦慮；γ-氨基丁酸；明暗箱；高架十字迷宮

 桑葉抗焦慮作用研究之高架十字迷宮、明暗箱測試

焦慮癥是一種具有持久性焦慮、恐懼、緊張情緒和植物神經活動障礙的腦機能失調，常伴有運動性不安和軀體不適感。臨床**焦慮癥的**主要有苯二氮卓類、非苯二氮卓類、抗抑郁藥以及腎上腺受體阻滯劑等，盡管這些**見效快、療效好，但易產生耐受性，長期應用可產生依賴性及突然停藥產生戒斷反應等。因此，尋找一種**有效的抗焦慮**迫在眉睫。

桑葉是一種藥食兩用產品，治病入藥始于東漢，具有疏散風熱、清肺**、平肝明目、涼血止血的功效?，F代藥理研究證明桑葉具有降血糖、***、**、抗病毒等作用，但對桑葉抗焦慮作用的研究報道極少。筆者等運用自主活動儀、明暗箱和高架十字迷宮多種焦慮動物模型觀察桑葉的抗焦慮作用，并初步探究其抗焦慮作用的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級昆明種小鼠，初始質量 18-22 g，雌雄各半，購自重慶市第三軍醫大學實驗動物中心。

1.2 **與試劑

桑葉，采自重慶北碚西南大學桑之源基地，經西南大學李學剛教授鑒定；地泮片劑（華中藥業股份有限公司，批號：20120601）；去甲腎上腺素（美國 Sigma 公司，批號：1001423402）；多巴胺（美國 Sigma 公司，批號：101171997）；5-羥色胺（美國 Sigma 公司，批號：1001344074）；無水乙醇（AR）；磺基水楊酸；高氯酸（AR）；乙酸鈉（色譜純）；乙酸（AR）；甲醇（色譜純）；乙二胺四乙二鈉鹽。

1.3 儀器

LC-6AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Auanti J-30I 高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；臺式低速大容量離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；JA2003B 電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；F6/10-6G 超細勻漿器 （弗魯克流體機械制造有限公司）。
備注：XR-XZ301 自主活動儀（上海欣軟信息科技有限公司）；自制明暗箱；XR-XG201 十字迷宮跟蹤分析系統 （上海欣軟信息科技有限公司）；

1.4 方法

1.4.1 真空處理的桑葉水提醇沉浸膏的制備 取新鮮桑葉 500 g，置于真空裝置中，于 20 ℃靜置 8 h。用蒸餾水回流提取 3 次，合并，減壓濃縮到 150-200 mL，添加 3 倍體積的 95%乙醇，放置冷卻 12 h 以上，過濾，上清液減壓濃縮至 200 mL 左右，備用。

1.4.2 動物分組及給藥 取 40 只 SPF 級昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分為空白對照組（蒸餾水 0.375 mL）、陽性**地泮對照組（0.002 3 g/kg）、桑葉組（4.5 g/kg）、真空處理桑葉組（4.5 g/kg）共 4 組，每組 10 只。桑葉、真空處理桑葉制成水提醇沉浸膏后給藥，連續灌胃給藥 6 d，1 次/d。

1.5 行為學實驗

1.5.1 桑葉對小鼠自主活動行為的影響 在第 4 天灌胃后分別于 0 h、1 h、2 h、3 h 將小鼠放入自主活動儀中測定 5 min 內小鼠的活動次數和站立次數。

1.5.2 桑葉對小鼠明暗箱行為的影響 在第 5 天灌胃 30 min后，將小鼠置于明暗箱的明箱中央，頭朝暗箱，記錄 5 min內小鼠的穿箱次數、小鼠在明箱的滯留時間及跨格次數。

1.5.3 桑葉對小鼠高架十字迷宮行為的影響 在第 6 天灌胃后的 30 min，將小鼠置于迷宮中央，頭朝閉臂。分別記錄 5 min 內小鼠進入開放臂和封閉臂的次數、停留時間

及在兩臂滯留的總時間。計算小鼠進入開臂的次數占總入臂次數（進入開臂和閉臂的次數之和）的百分率（OE%）及在開臂滯留時間占總入臂時間（在開臂和閉臂滯留時間之和）的百分率（OT%）。

1.6 小鼠腦組織內 NE、DA、5-HT 含量測定

1.6.1 樣品預處理 行為學實驗后，立即斷頭處死小鼠，迅速取出腦組織，稱重后放入加 500 μL 0.4 mol/LHClO4的 Ependet 離心管中，冰浴勻漿。渦旋后置冷凍離心

機 （4 ℃），10 000 r/min 離 心 10 min， 將 上 清 液 轉 入Eppen-dorf 離心管中，再次離心，取上清液，用 HPLC 法測定腦組織中 NE、DA、5－HT 含量。

1.6.2 色譜條件 色譜柱為 Hypersil ODS2高效液相色譜柱 （4.6 mm × 200 mm，5 μm）。流動為 0.1 mol/L 的CH3COONa 緩 沖液 - 甲醇（9 ∶1），流速 1.0mL/min，進樣量每次 20 μL。發射波長 330 nm，激發波長 290 nm。柱溫：25 ℃。1.7 統計學處理用 SPSS17.0 軟件對數據進行統計，采用單因素方差分析 （One-way ANONA） 進行檢驗，多組間比較采用Duncan’s Test 檢驗，數據以 X±S 表示。

2 結果

2.1 桑葉對小鼠自主活動的影響

與空白對照組比較，**組在灌胃后 2 h，小鼠在自主活動儀中的活動次數和站立次數均減少，且真空處理桑葉組與空白對照組有顯著性差異（P<0.05）。

2.2 桑葉對小鼠明暗箱行為的影響

與空白對照組比較，**組均能增加小鼠跨格次數、在明箱的滯留時間。兩個桑葉組小鼠在明箱內的跨格次數與空白對照組比較差異顯著（P<0.05）。同時，真空處理桑葉組小鼠在明箱滯留時間與空白對照組比較差異顯著（P<0.05）。

2.3 桑葉對小鼠高架十字迷宮行為的影響

與空白對照組相比，**組均能增加小鼠開臂進入次數百分比（OE%）、開臂滯留時間百分比（OT%）。地泮組及真空處理桑葉組 OE%、OT%與空白對照組比較均有顯著性差異（P<0.05）。

2.4 桑葉對小鼠腦組織中神經遞質含量的影響與空白對照組相比，**組小鼠腦組織中 NE、DA、5-HT 含量均降低。兩個桑葉組小鼠腦組織中 5-HT 含量與空白對照組比較有顯著性差異 （P<0.05）。3 討論

桑葉中 GABA 的平均含量可達 2.26 mg/g，真空處理后的桑葉中 GABA 的含量將會增加。GABA 是**神經系統中含量*多、*重要的抑制性神經遞質，通過與下一個神經元膜上的受體結合，開放氯離子通道，使氯離子內流，使細胞膜超極化，抑制動作電位的發生，從而阻止焦慮相關的信息抵達腦指示**。本研究結果顯示，桑葉和真空處理后的桑葉對小鼠的**神經系統均有抑制作用，且后者作用強于前者，說明桑葉中 GABA 含量越高，其抑制作用越明顯。
明暗箱、高架十字迷宮都是評價**抗焦慮作用的經典實驗模型。桑葉水提醇沉浸膏和真空處理后的桑葉水提醇沉浸膏都表現出對小鼠的抗焦慮作用，且真空處理后的桑葉組較空白對照組有顯著性差（P<0.05），說明桑葉中的 GABA 含量越高，其抗焦慮作用越明顯。5-HT 是與心境障礙相關的關鍵性神經遞質，目前研究認為 5-HT 的多個受體皆與焦慮障礙有密切關系。其中，5-HT3受體屬于配體門控離子通道偶聯受體，激活 5-HT3受體可以開放陽離子通道而觸發細胞快速去極化，導致胞漿內鈣離子濃度迅速升高，繼而誘發神經元釋放遞質。而抑制性神經遞質 GABA 使細胞膜超極化，不容易去極化，導致 5-HT3受體不能激活，從而抑制 5-HT 釋放。此外，5-HT1B、5-HT2C與 GABA 也有相互調節作用。同時，焦慮癥的產生還與 NE、DA 的釋放有關，已有動物實驗發現，焦慮模型小鼠腦組織內的NE、DA、5-HT 都有升高，而使用抗焦慮**的小鼠腦內這 3 種神經遞質水平會降低。本研究用 HPLC 色譜法分析行為學實驗后的小鼠大腦中 NE、DA、5-HT 含量，**組 3 種神經遞質含量較空白組均降低，證明了桑葉的抗焦慮作用。桑葉抗焦慮作用研究之高架十字迷宮、明暗箱測試

綜上所述，桑葉抗焦慮作用可能是桑葉中的 GABA 作用于**神經系統，與 NE、DA、5-HT 協同作用阻礙焦慮信息的傳達，從而產生抗焦慮作用，具體機理有待進一步研究。