前 言

    重復經顱磁刺激(rTMS)是一種無損傷的物理**方法，目前已逐漸得到人們關注，在臨床主要用于精神神經系統**的**，可以改善神經系統退行性**的相關癥狀，如減輕帕金森病相關非運動癥狀，改善抑郁程度，調節阿爾茲海默病人的認知功能。研究表明，長期的高頻 rTMS還可以抑制正常老化過程中的認知功能降低。研究還指出，rTMS 可以通過多通路，網絡化的方式來改善個體的腦組織結構和功能并提高個體的認知功能。

    腦老化是指老化過程中伴隨的腦組織結構和功能的變化。在健康個體，隨著年齡的增長，腦老化的進程的發展，健康個體的認知功能也可表現為學習記憶能力的降低。而且在老化過程中，老化的腦組織也更容易患有神經系統退行性**。嚙齒類動物作為實驗模型研究腦老化及老化相關的認知功能障礙具有很多優點，例如，與人類相似，嚙齒類動物的海馬和前額皮層在老化中也是非常容易受損傷的，表現為腦組織結構和功能的變化。已有研究報道，昆明小鼠在老化過程中可表現出學習記憶能力的下降，可以作為研究腦老化的理想動物模型。在對嚙齒類動物進行認知功能的評估中，被動逃避反應和新物體識別實驗是經典的認知行為學檢測工具。

因此，本部分實驗應用昆明小鼠為研究對象，觀察昆明小鼠在老化過程中的何種程度會出現認知功能損傷，并觀察 rTMS 是否可以改善老化引起的認知功能障礙。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 主要實驗儀器

磁刺激儀器、被動逃避反應箱、新物體識別箱 （購自上海欣軟信息科技有限公司）   

1.2 藥品及試劑

75%酒精 天津市永大化工實驗廠

2 實驗分組及程序

動物分組及方法：3-4 月齡昆明小鼠，9-10 月齡昆明小鼠，16-17 月齡昆明小鼠。在實驗室恒溫 20-25 攝氏度飼養，然后用于實驗。

實驗分組，將昆明小鼠為以下 4 組：

（1）老年 rTMS 組：16-17 月齡老年小鼠，磁頭于小鼠的顱頂部每天進行 10 組頻率為 25 赫茲的磁刺激，總共刺激脈沖個數為 1000 個，連續14 天。

（2）老年 sham 組：16-17 月齡老年小鼠，以磁頭反面于小鼠顱頂部進行與 rTMS 組相似的無功能的磁刺激。

（3）成年組：9-10 月齡成年小鼠，與老年 sham 組小鼠刺激方式相同。

（4）青年組：3-4 月齡青年小鼠，與老年 sham 組小鼠刺激方式相同。

各組動物在相同環境下飼養，然后進行為期 14 天的 rTMS 或者假刺激，刺激結束后通過被動逃避反應箱實驗和新物體識別箱實驗測試其學習記憶能力的改變。

3 被動逃避反應實驗

在連續 14 天的 rTMS 或 sham 磁刺激后的**天，應用被動逃避反應實驗對昆明小鼠進行認知功能測試。被動逃避反應實驗裝置是一個不透明塑料箱（箱體為 18 cm × 12 cm × 12 cm），箱內靠近一側箱體放置有一個絕緣塑料平臺(直徑 5 cm；高 4.5 cm)。箱底由直徑 0.2 cm 間隔 1 cm 的銅柵構成，銅柵可通電。

**天為適應性訓練，將小鼠面對箱體側壁放置于平臺上，任其在箱內自由活動，適應訓練時間 300 s。小鼠會在放入箱內后的一個很短的時間內跳下窄小，升高的平臺，記錄這一時間。實驗的**天進行認知訓練，即在適應訓練 24 h 后：箱底通電(36 mV)，將小鼠面對箱體側壁放在平臺上，小鼠跳下平臺即被電擊，返回平臺，認知訓練 5 min 后取出小鼠，記錄小鼠跳下平臺被電擊次數作為認知功能指標。實驗第三天進行記憶檢測，即在認知訓練 24 h 后：箱底通電，將小鼠面向箱體側壁放在平臺上，記錄小鼠**次跳下平臺的時間即逃避潛伏期，作為**個認知功能指標，如果在 300 s 內小鼠都不跳下平臺，則逃避潛伏期記為 300 s。以電擊次數和逃避潛伏期反應小鼠認知功能。

4 新物體識別實驗

每一只小鼠被單獨放入一箱體內(30×30×30 cm)。箱體內放有兩個不同物體，并間隔 15 厘米。在實驗**天，每只小鼠在箱體內自由適應 20分鐘。1 小時后，其中一個物體被一形狀不同的新物體所替換，將小鼠放入，觀察并記錄 5 分鐘內小鼠觸碰兩個物體的時間。24 小時后，另一個物體被另一個形狀不同的新物體所替換。觀察并記錄 5 分鐘內小鼠觸碰兩個物體的時間。實驗過程中每只小鼠進行完一部分實驗后用酒精擦拭實驗箱消除**氣味對測試成績的干擾。在新物體識別測試中反應認知功能的指標被稱為認知指數，即小鼠觸碰新物體的時間與小鼠觸碰兩個物體時間總和的比值。因為嚙齒類動物具有探索新事物的本性，認知指數的增長可以反應認知功能的提高。

5 統計學處理

采用 SPSS 16.0 軟件進行統計處理，數據以均數±標準差（mean±SEM）表示。應用 one-way ANOVE 統計分析方法對實驗數據進行分析，以 P<0.05 為有統計學意義。

結 果

1 新物體識別實驗成績的改變

1.1 老化過程中新物體識別成績的下降

在 1 h 時間點，小鼠觸碰兩物體的總時間在青年組、成年組和老年組之間沒有明顯差異(Fig. 1A)，在 24 h，小鼠觸碰兩物體的總時間在三組之間也沒有發現顯著差異(Fig. 1 B)。在 1 h 時間點青年組和成年組小鼠之間的認知指數沒有明顯差異，與青年組和中年組相比，老年組小鼠的認知指數顯著降低(Fig. 2)。同樣在 24 h 時間點，與青年和中年組相比，老年組小鼠的認知指數顯著降低，而青年組和中年組小鼠之間沒有顯著差異。1.2 rTMS 顯著改善了老年小鼠的新物體識別實驗的成績。

在 1 h 時間點，小鼠觸碰兩物體的總時間在老年組和老年 rTMS 組沒有明顯差異(Fig. 1A)，同樣在 24 h，小鼠觸碰兩物體的總時間在兩組之間也沒有發現顯著差異(Fig. 1 B)。在 1 h 時間點老年組和老年 rTMS 組小鼠之間的認知指數沒有明顯差異，與老年組相比，老年 rTMS 組小鼠的認知指數顯著提高(Fig. 2)。同樣在 24 h 時間點，與老年組相比，老年 rTMS組小鼠的認知指數顯著提高。

2 被動逃避反應實驗成績

2.1 老化過程中被動逃避反應成績的改變

被動逃避反應實驗適應階段的潛伏期在青年組、成年組和老年組之間沒有顯著差異(Fig. 3)。與青年組和中年組相比，學習階段的電擊次數在老年組昆明小鼠明顯增多(Fig. 4)，而青年組和成年組小鼠學習階段的電擊次數無顯著差異。與青年鼠和成年鼠相比，記憶階段的被動逃避潛伏期在老年組小鼠顯著縮短，同樣青年組和成年組之間記憶階段的被動逃避潛伏期沒有顯著差異(Fig. 5)。上述結果表明，昆明小鼠的認知功能在 16 月齡時出現了損傷。重復經顱磁刺激改善老化引起的認知功能障礙

2.2 rTMS 顯著提高了老化過程中被動逃避反應成績

被動逃避反應實驗適應階段的潛伏期在老年組和老年 rTMS 組小鼠之間沒有顯著差異(Fig. 3)。與老年組相比，學習階段的電擊次數在老年rTMS 組昆明小鼠顯著減少(Fig. 4)。同樣與老年組小鼠相比，記憶階段的被動逃避潛伏期在老年 rTMS 組小鼠出顯著增長(Fig. 5)。上述結果表明，rTMS 可以改善昆明鼠在老化過程中出現的認知功能損傷。

討 論

腦老化過程中伴隨著腦組織結構和功能的改變，老年個體并表現出認知功能的下降。前額皮層和海馬是學習記憶的關鍵**，是在年齡增長過程中也是*易受損傷的腦區。因此，與此部分腦區相關的學習記憶能力也會伴隨著年齡的增長而出現損傷。嚙齒類動物因其應用廣泛，是對認知功能進行研究的良好的動物模型，可用于探討認知功能改變的內置分子生物學機制。與人類相似，嚙齒類動物的學習記憶能力在老化過程中出現了下降，并且伴隨著前額皮層和海馬相關腦區的學習記憶能力的損傷。

因此，應用嚙齒類動物進行實驗，研究老化過程認知功能受損的具體機制具有非常重要的意義。嚙齒類動物學習記憶的變化可以應用行為學測試方法進行檢測。被動逃避反應實驗和新異物體識別實驗是檢測嚙齒類動物認知功能的經典認知行為學測試方法并可檢測與額皮層和海馬區密切相關的認知功能。昆明小鼠是我國*常用的實驗動物模型，具有可操作性強、價格低等優點。因此本實驗采用昆明小鼠進行的研究，觀察小鼠在老化過程中認知功能的變化，我們的研究結果與已有的研究報道相似，昆明小鼠在老化過程中出現了增齡相關的認知功能障礙。在本課題中我們分別應用了跳臺被動逃避實驗方法從動物的被動學習能力，新異物體識別方法對動物的天性偏愛記憶進行了觀察，發現老化過程中昆明小鼠的被動和主動學習記憶能力都受到了損傷。我們首先證明了昆明鼠在 9 月齡時的認知功能沒有發生變化，而小鼠的認知功能的減低出現在 16 月齡。重復經顱磁刺激改善老化引起的認知功能障礙

rTMS 是一種**、非侵入性的物理**方法。目前在臨床得到廣泛應用，在神經精神系統**的預防和**中具有良好的效果。在神經系統退行性**的**中的應用也逐步得到人們重視。研究表明 rTMS 可以改善正常老化過程中的學習認知功能降低。rTMS 可以調節神經元突觸可塑性，改善長時程增強（LTP）現象。研究報道應用高頻的 rTMS 在改善動物 LTP 的同時可以提高其新物體識別的成績。在我們的研究中同樣發現，rTMS 可以改善老化過程中昆明小鼠的被動逃避反應成績和新物體識別實驗成績。為進一步探討 rTMS 改善正常老化過程中認知功能損傷的深入機制選擇了一種較為理想的動物模型。

小 結

昆明小鼠的認知功能在青年組和成年組沒有出現明顯差異，而在 16月齡時開始出現下降，而應用 rTMS 可以改善老化引起的認知功能損傷。