摘要 　 本文觀察了熱應激預處理對腦缺血 / 再灌注昆明小鼠海馬神經元的保護作用。實驗采用昆明小鼠以雙側頸總動脈夾閉7 m i n后再通制作腦缺血 / 再灌注模型 ,在缺血 / 再灌注前予以熱應激預處理。 根據不同的處理方法將動物隨機分為四組 : ( 1 ) 正常對照組 , ( 2 )熱應激預處理后缺血再灌注組 ( HS / I R ) , ( 3)缺血再灌注組 ( I R ) , ( 4 )單純熱應激組 ( HS) ,后 3 組又分別分為 1 d 、4 d和 14 d三個亞組。水迷宮檢測小鼠學習記憶的行為改變 , **組織化學染色結合圖像分析技術檢測缺血 / 再灌注對海馬C A1 區(qū)神經元微管相關蛋白 2 2 (MAP-2 ) 的影響 , N issl染色計數 C A1 區(qū)神經元的數目。結果表明 : 與正常組、 HS 和 HS / I R 組比較 , I R組小鼠水迷宮檢測逃避潛伏期增加 ( P < 0 . 01 ) ,其搜索策略以邊緣式和限制式為主 ,而其它三組搜索策略則以趨向式和直線式為主。N issl染色顯示 I R組和 HS / I R組海馬錐體細胞減少 ,且 I R組細胞丟失比 HS / I R組更多 ( P < 0 . 05 ) ; MAP-2 **組化染色顯示 4 d時海馬 C A1區(qū)輻射層的樹突發(fā)生紊亂和斷裂 , MAP-2 有明顯減少 ( P < 0 . 05 ) , 14 d時 I R組 MAP-2 陽性表達主要聚集于胞漿中。以上實驗結果提示 ,熱應激預處理可以通過對海馬神經元的保護作用改善動物腦缺血 / 再灌注引起的學習記憶能力的下降。

關鍵詞 　　 熱應激 　 Morris水迷宮 　 微管相關蛋白 2 2　 缺血 / 再灌注 　 海馬

　　 微管相關蛋白-2 ( microtubule associated protein2 , MA P-2 )是細胞骨架蛋白的一種 , 主要位于神經元的樹突內 ,對穩(wěn)定微管結構的完整性具有重要作用 ,同時可介導神經細胞內微管與其它細胞器間的相互作用 , 與神經細胞的正常功能密切相關。MA P-2對腦缺血所導致的損傷很敏感 , 常作為缺血損傷的主要指標 。海馬是缺血損傷敏感區(qū) , 而海馬與情緒 、 學習和記憶等腦的**功能密切相關 ,因而缺血性腦損傷也將導致學習和記憶功能 , 特別是空間辨別功能的障礙 。

近年發(fā)現(xiàn)經過預處理的組織器官對隨后嚴重損傷的耐受性明顯增強 ,這種現(xiàn)象稱之為預適應 ,如缺血預適應 、 熱應激預適應等 。熱應激能對器官起保護性作用的現(xiàn)象早已被人們所發(fā)現(xiàn) , 其中**性熱水浴在中國 、 日本 、 芬蘭等國家廣泛被使用。有實驗研究表明熱應激預適應能增強心臟組織對缺血的耐受性 ,但熱應激預處理是否對因缺血所致的腦 ,特別是海馬神經元損傷具有類似的保護作用 , 尚未見文獻報道。本實驗采用雙側頸總動脈夾閉制作昆明小鼠腦缺血 / 再灌注模型 ,觀察熱應激預處理對小鼠學習 、 記憶和海馬神經元的影響 ,探討熱應激預處理對缺血腦組織的保護作用 。

材料和方法

1 . 　 實驗動物及分組

健康 6 月齡昆明小鼠 72 只 ( 雌雄不限 ) , 體重( 40 ± 5 ) g,由中南大學實驗動物學部提供 。實驗動物依據不同的處理方法分為 4 組 : ( 1 ) 正常對照組(No r m a l , n =18 ) ; ( 2 ) 熱應激預處理后缺血再灌注組 ( HS / I R , n = 18 ) ; ( 3 ) 缺血再灌注組 ( I R , n =18 ) ; ( 4 ) 單純熱應激組 ( H S, n = 18 ) 。H S組 、 I R 組和 H S / I R 組又分為 1 d 、 4 d 、 14 d 三個亞組 ( n = 6 / 亞組 ) 。

2 . 　 試劑

大鼠抗 MAP-2單克隆抗體購自 Sternberger Monclonnals公司 ,羊抗鼠 I gG 、ABC試劑盒購自美國V ector 公司 , DAB、 Triton X-100 購自 Sigma 公司 ,30 % H2O2 為上海桃浦化工廠產品 。

3 . 　 Morris水迷宮測試

水迷宮購自上海欣軟信息科技有限公司，材質采用ABS工程塑料（汽車、飛機外殼材質）模具制作，水池上空通過一攝像機和計算機相連接. 水池直徑約160cm ,深約50cm ,站臺高度 29c m ,池內容自來水 ,水深 30 c m ,并用不透明的大小均勻的白色塑料泡沫覆蓋 ,液面距池壁上緣 20 c m , 水溫保持在 ( 22～26 ) ℃ 。 將圓池分為東南 、 東北 、 西南 、 西北 4 個象限 ,站臺位于其中任一象限內 , 距圓心 24 c m , 站臺頂端平面位于液面下 1 c m 。 圓池置于光線良好

的實驗室內 ( 3 m × 5 m ) ,包括相對固定的迷宮外視覺線索 ( 工作臺 、 椅子 、 門 、 窗 、 書架及電燈等 ) 。每只動物每天訓練 4 次 , 歷時 3 d,全部行為學訓練均在 10 ∶ 00 a m ～5 ∶ 00 p m 之間完成 。逃避潛伏期 : 檢測時將小鼠頭朝池壁輕輕放入水中 ,同時開始計時 ,動物自入水后至找到平臺后四肢爬上平臺所需時間作為逃避潛伏期 。搜索策略 : 觀察動物入水后尋找站臺的游泳軌跡以確定其搜索策略 。記錄小鼠后 8次測試潛伏期 , 計算其均值 , 以平均潛伏期的 90 %區(qū)間作為篩選學習記憶功能正常小鼠的標準 , 若未能達到此要求的動物則棄去不用 。 在各組動物處理后各時間點再作水迷宮檢測 , 比較各組動物處理前后潛伏期的差別以及游泳軌跡的改變 。

4 . 　 動物模型制作

4 . 1 　 熱應激動物模型 　　H S 、 HS / I R 組的小鼠用2 %****鈉 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉 ,置于帶鼓風裝置且具有適當濕度的烤箱內 , 當小鼠的體溫升至 ( 42 . 0 ± 0 . 5 ) ℃ ( 肛溫 ) 時維持 15 m i n, 然后到常溫環(huán)境 下 恢 復 1 h, 再 次 升 高 體 溫 至 ( 42 . 0 ± 0 .5 ) ℃,反復 3次 。

4 . 2 　 腦缺血 / 再灌注動物模型 　　H S / I R、 I R 組的小鼠行缺血 / 再灌注處理 , 其中 HS / I R 組的動物于熱應激預處理后 24 h再實施以下操作 : 用 2 %****鈉 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉 , 仰臥固定于手術臺上 ,頸前正中切口 , 鈍性分離雙側頸總動脈 , 微動脈夾夾閉雙側頸總動脈 7 m i n,小鼠在夾閉雙側頸總動脈 60 s內昏迷 ,翻正反射消失 ,雙側瞳孔放大 ,動物瞳孔在缺血時變?yōu)樯n白并于整個缺血期維持不變 ,但能自主呼吸 。實驗中保持小鼠體溫在 ( 37 . 0± 0 . 5 ) ℃ ( 肛溫 ) ,未昏迷的動物說明未達到損傷的

要求 ,不予采用 。 腦缺血 7 m i n后解除動脈夾 ,恢復腦血流 。 再灌注后瞳孔顏色立即轉變?yōu)轷r紅色 , 分別于再灌注后 1 d 、 4 d 、 14 d處死動物 。 各組動物在各種處理前作 Mo rris水迷宮測試 , 以比較不同處理方法對學習記憶的影響 。

5 . 　 組織制備

用 2 %****鈉 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉動物 ,開胸后于動物左心室插管至升主動脈 ,剪開右心房 ,先灌注生理鹽水 30 m l , 隨后灌注 4 ℃ 預冷的含4 %多聚甲醛的磷酸緩沖液 ( 0 . 1 mo l /L , pH 7 . 4 ) 60923 王春旭等 : 熱應激對小鼠海馬神經元的保護作用

m l 。 恒溫切片機作連續(xù)冠狀切片 , 片厚 30 μ m , 取海馬和齒狀回平面 。

6 . 　 **組織化學

切片依次經以下處理 : 0 . 01 mo l /L P B S洗 5 m i n× 3次 , 1 % H2 O2 室溫下處理 30 m i n; 再次用 P B S洗5 m i n × 3 次 , 0 . 3 % Trit on X2 100 + 5 % B S A 室溫封閉 1 h; 加大鼠抗 MA P2 2 單克隆抗體 ( 1 ∶ 5000 ) , 4 ℃孵育 24 h; 加生物素化羊抗大鼠 I gG ( 1 ∶ 200 ) , 室溫孵育 2 h; 加生物素 - 卵白素 - 辣根過氧化物酶復合物 (ABC, 1 ∶ 150 ) , 室溫下孵育 1 ～1 . 5 h 。各抗體轉換時均用 P B S洗 5 m i n × 3 次 ; 0 . 05 % DAB + 0 . 01 %H2 O2 避光呈色 ,鏡下控制反應深度 。貼片 、 常規(guī)脫水 、 透明 、 封片 。O l y mp u s顯微鏡觀察并拍片 。陰性對照中以 P B S代替一抗 ,結果為陰性 。

7 . 　 N issl 染色

常規(guī) N issl 染色 ,用以計數海馬 C A1區(qū)神經元 。

8 . 　 數據收集處理

光學顯微鏡下觀察并計數海馬 C A1 區(qū)神經元 。用 H P I A S高清晰度彩色病理圖像測量系統(tǒng)測定海馬 C A1 區(qū)神經元胞漿 MA P2 2 陽性表達產物的平均灰度值 ( 自動矯正背底灰度值 ) , 數值越大表明灰度越低 。 每例標本檢測 3 張切片 , 每張切片檢測 3 個視野 。 實驗數據用 SPSS 10 . 0 統(tǒng)計軟件分析 , 樣本均數的比較采用成組設計多個樣本均數比較的單因素方差分析 。 P < 0 . 05 為差異有統(tǒng)計學意義 。

結 　　 果

1 . 　 行為學檢測

正常對照組小鼠的逃避潛伏期時間比較穩(wěn)定 ,在 20 s左右可找到平臺 ; H S組和 H S / I R 組小鼠的逃避潛伏期時間與正常組比較略有增加 , 且波動較大 ,但無統(tǒng)計學意義 ( P > 0 . 05 ) 。處理后 14 d, 記錄各組動物搜索策略顯示上述 3組動物均以直線式和趨向式搜索策略為主 , 邊緣式的搜索策略少 。而I R 組小鼠在再灌注后 4 d 和 14 d 的逃避潛伏期顯

著增加 ,與正常對照組 、 HS組 、 H S / I R 組相比逃避潛伏期明顯延長 ( P < 0 . 01 ) , I R 組搜索策略也轉變?yōu)檫吘壥胶拖拗剖綖橹?nbsp; 。

2 . 　 N issl 染色結果

在 N issl染色的切片上 ,正常對照組和 H S組小鼠海馬 C A1區(qū)神經元的形態(tài)沒有明顯的差別 ,均可見數層錐體細胞排列整齊規(guī)則 ,胞漿染色清晰 ,胞核淡染 ; 而 I R 組和 HS / I R 組海馬 C A1 區(qū)錐體神經元胞體腫脹 ,排列散亂 , 細胞間距加大 , 錐體神經元數目減少 ( F i g . 1 A 2 D ) 。小鼠海馬 C A1 區(qū)存活錐體細胞計數表明 , 4 d后 HS / I R 組和 I R 組神經元數較正常組和 H S組明顯減少 ( P < 0 . 01 ) ; 4 d 和 14 d I R組神經元數與 H S / I R 組比較錐體細胞進一步減少( P < 0 . 05 ) 。

3 . 　 MA P-2**組織化學染色結果

正常組與 HS組的 MA P-2**陽性產物在形態(tài)和分布上相似 , MA P-2 陽性的樹突平滑 、 完整 , 而核周 MA P-2陽性產物較弱 ; 4 d I R 組海馬 C A1 區(qū)輻射層 MA P-2陽性產物減弱 ,突起斷裂 ,螺旋化改變 ;而 HS / I R 組輻射層 MA P-2 表達與正常組相似 ; 14 d的 I R 組觀察到海馬 C A1 區(qū)錐體神經元樹突 MA P-2幾乎消失 ,而在核周有 MA P-2聚集 ( F i g . 1 E～ I ) 。 采用平均灰度值表示 MA P2 2 的陽性**產物 , 反應產物少的平均灰度值高 。 與正常組 、 HS組和 H S /I R 組比較 , 4 d 的 I R 組海馬 C A1 區(qū)輻射層 MA P-2陽性產物減弱 ( P < 0 . 05 ) 。

討 　　 論

1 . 　 熱應激預處理對動物行為學的影響

學習記憶行為學檢測方法主要有 Y迷宮 、 水迷宮 、 跳臺實驗 、 避暗實驗等 , 而 Mo rris水迷宮因其操作簡便 ,可記錄指標較多而成為應用*為廣泛的一種 。 本實驗采用昆明小鼠手術前后 Mo rris水迷宮測試來評估處理因素對學習記憶能力的影響 。 結果表明 ,與 HS組 、 H S / I R 組和正常組比較 , I R 組小鼠逃避潛伏期明顯下降 ,而且 I R 組小鼠的搜索策略也相應地發(fā)生了變化 ,由正常組的直線式為主轉變?yōu)檫吘壥胶碗S機式為主 , 表明小鼠的空間辨別和記憶能力下降 。HS組和 HS / I R 組動物的直線式搜索策略相對減少 ,而趨向式的搜索策略比對照組相對增加 ,可能是因為直線式搜索策略需要**的記住平臺所在的位置 。 任何對方向的不確定和對平臺位置的猶豫都可能導致搜索方式從直線式變?yōu)橼呄蚴?nbsp;。 但是采用直線式和趨向式搜索策略的小鼠都具有較好的記憶能力。 本實驗的結果提示 HS組和 HS / I R 組小鼠的記憶能力好于 I R 組小鼠 ,即熱應激預適應對因腦缺血所致的學習記憶功能障礙具有一定的保護作用 。熱應激對小鼠海馬神經元的保護作用

2 . 　 熱應激預適應與海馬神經元骨架蛋白

腦缺血時 , 海馬 C A1 區(qū)為易損區(qū) , C A3 區(qū)為相對耐受區(qū)。神經元骨架蛋白是缺血損傷敏感的指標 ,其完整性對維持神經元的形態(tài)和功能有重要作用 。 微管相關蛋白-2 (MA P-2 ) 是神經元內重要的細胞骨架蛋白成分 , 在神經元發(fā)育 、 分化 、 可塑性方面起著主導作用。MA P-2 有許多重要功能 , 包括快速軸漿運輸與神經遞質釋放 , 神經元發(fā)育過程中的構型與穩(wěn)定等 。MA P-2 的形態(tài)和結構的損壞可以導致神經元的功能障礙 , 甚至神經元死亡。電鏡觀察表明 ,即使短暫缺血也會引起細胞骨架的紊亂及蛋白成分不可逆變性 , MA P-2 對腦缺血易敏感 ,常作為缺血誘導神經元損傷的早期標記物。熱應激對小鼠海馬神經元的保護作用

本實驗表明 ,正常對照組海馬 C A1區(qū) MA P-2 **陽性的樹突平滑且完整 , 直徑均勻 ; 而腦缺血 / 再灌注后 4 d, MA P-2 **陽性的樹突出現(xiàn)斷裂 、 螺旋化改變 , 海馬 C A1 區(qū)輻射層 MA P-2 表達明顯減弱( P < 0 . 05 ) 。 這種現(xiàn)象在本室以前的研究中也得到了證實。 經過熱應激預處理腦缺血 / 再灌注后 4d,海馬 C A1 區(qū)神經元的樹突結構沒有發(fā)生明顯斷裂 、 螺旋化改變 ; H S / I R 組輻射層 MA P2 2 與正常組比較無明顯差別 ,同時神經元的數量也無明顯丟失 ,提示熱應激預適應可以使神經元骨架蛋白成分免受缺血損傷 。缺血性腦損傷后 , 除了存在一種主動性的程序性細胞死亡 ( 凋亡 )過程 , 在耐受細胞內還存在一種主動性神經元存活過程。14 d的 I R 組觀察到海馬 C A1 區(qū)錐體神經元樹突 MA P-2 幾乎消失 ,而在核周有 MA P-2聚集 。本室以前的研究證明隨著腦缺血再灌注時間的延長 , MA P-2 在神經元內分布的改變 : 樹突內的 MA P-2 表達減少 , 轉而出現(xiàn)胞漿內的表達增加 ,推測細胞開始合成新的微管蛋白 ,參與細胞的主動性修復 ,維持細胞的存活。總之 ,熱應激可改善小鼠空間學習記憶能力 ,這可能與熱應激減少 C A1 區(qū)神經元丟失 ,保護 MA P-2免受缺血損傷有關 ,其機制有待深入研究 。