動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺評(píng)估方法概述

【摘要】  嗅覺功能目前正受到越來越多的關(guān)注，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的嗅覺評(píng)估方法很多，但是目前為止還沒有一個(gè)**、客觀、高特異性的金標(biāo)準(zhǔn)方法出現(xiàn)，本文就目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的常見的嗅覺評(píng)估方法(包括行為學(xué)、影像學(xué)、電生理學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等多種類型的實(shí)驗(yàn)方法)進(jìn)行一個(gè)概括性的介紹并簡(jiǎn)單分析其優(yōu)缺點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】  嗅覺; 嗅覺障礙; 評(píng)估方法; 動(dòng)物實(shí)驗(yàn); 文獻(xiàn)綜述

　嗅覺是人體原始的感覺功能之一，它同視覺、聽覺一樣，是人體捕獲外界信息的特殊裝置。嗅覺還可以通過**神經(jīng)系統(tǒng)影響人的情緒、調(diào)節(jié)生命周期。嗅覺障礙患者對(duì)周圍的事物不感興趣，反應(yīng)平淡，生活質(zhì)量下降，更可以造成精神上的壓抑或憂郁。王鴻等[1]報(bào)道用T&T測(cè)試法測(cè)試了1 035例慢性鼻竇炎鼻息肉患者，86.3%的患者有嗅覺功能障礙，與患者的主訴有極顯著的差異，說明嗅覺功能改變沒有受到患者的注意。近幾年隨著人們對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，對(duì)嗅覺障礙的關(guān)注程度有了很大的提高。

　　嗅覺評(píng)估不僅僅是要判斷嗅覺功能是否正常，還需要進(jìn)一步判斷嗅覺障礙的程度、性質(zhì)、部位等因素，如果能提示病因以及預(yù)后則更有臨床、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的價(jià)值。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中關(guān)于嗅覺功能的研究已經(jīng)有了較長(zhǎng)的歷史，出現(xiàn)了多種實(shí)驗(yàn)方法，但是目前為止還沒有一個(gè)**、客觀、高特異性的金標(biāo)準(zhǔn)方法出現(xiàn)，本文就目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的常見的嗅覺評(píng)估方法進(jìn)行一個(gè)概括性的介紹。

　　1 行為學(xué)方法

　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的*大區(qū)別在于動(dòng)物無法準(zhǔn)確地和實(shí)驗(yàn)者交流，所以行為學(xué)方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中就顯得極為重要。嗅敏動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力、尋食能力等與嗅覺有很高的相關(guān)性，可以觀察、記錄其行為學(xué)的改變，從而判斷其嗅覺功能的變化。目前報(bào)道較多的可以評(píng)估嗅覺功能的行為學(xué)方法有以下幾種。

　　1.1 埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)(buried food pellet test，BFPT)

　　BFPT是目前*常用于檢測(cè)動(dòng)物嗅覺功能的行為學(xué)檢測(cè)方法[2]。目前比較通用的方法由Nathan等[3]于2004年報(bào)道，他的實(shí)驗(yàn)中使用找尋食物小球等待時(shí)間作為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即從小鼠被隨機(jī)放置于盒子中開始，到小鼠揭開食物小球并用它的前爪或牙齒抓住食物小球的時(shí)間，如果5 min(300 s)內(nèi)小鼠未找到食物小球，即被移走。林靜等[4]以300 s(5次測(cè)試的平均值)內(nèi)未找到食物小球作為判定小鼠存在嗅覺功能障礙的標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)為以300 s作為分組標(biāo)準(zhǔn)是合理的。

　　1.2 嗅覺測(cè)量?jī)x

　　Slotnick等[5]利用行為學(xué)原理設(shè)計(jì)出一種用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的嗅覺測(cè)量?jī)x，可以通過改變氣味的濃度后觀察動(dòng)物的行為學(xué)變化來評(píng)價(jià)其嗅覺。該系統(tǒng)經(jīng)眾多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)動(dòng)物嗅覺的檢測(cè)是有效的，因操作方便且可進(jìn)行多種設(shè)計(jì)，此方法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物嗅覺功能的評(píng)估。

　　1.3 雙瓶實(shí)驗(yàn)

　　有研究證實(shí)小鼠、大鼠在分辨某些物質(zhì)的時(shí)候主要是依賴于嗅覺而非味覺，例如鹽酸、鹽酸奎寧(quinine HCl, QHCl)等有一定揮發(fā)性的物質(zhì) [7]。因嗅覺障礙時(shí)動(dòng)物分辨飲用水和實(shí)驗(yàn)溶液的能力下降，通過兩種溶液被動(dòng)物飲用的程度可以評(píng)估動(dòng)物嗅覺障礙的程度。

　　1.4 幼鼠超聲發(fā)聲實(shí)驗(yàn)

　　新生小鼠嗅覺的產(chǎn)生比其他的感覺要早。新生小鼠嗅到成年鼠窩的氣味時(shí)可發(fā)出一種超聲作為回應(yīng)，檢測(cè)這種超聲的出現(xiàn)與否可以判斷其嗅覺功能是否正常[8]。Lemasson等[8]用3甲基吲哚來破壞新生小鼠的嗅上皮，結(jié)果成功地證實(shí)了該檢測(cè)方法的可行性。而且在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于被破壞嗅覺的小鼠無法正確識(shí)別**，其生存率大大降低，證明了嗅覺對(duì)新生小鼠有極其重要的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺評(píng)估方法概述

　　行為學(xué)方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的嗅覺評(píng)估中有很重要的作用，歷史悠久、技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)方法較為簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)裝置花費(fèi)較少，對(duì)嗅覺功能的初步評(píng)估價(jià)值較為肯定(尤其是埋藏食物小球?qū)嶒?yàn)和Slotnick的嗅覺測(cè)量?jī)x)，可行性及可重復(fù)性較高。需要注意的是本類實(shí)驗(yàn)受個(gè)體差異影響較大，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)經(jīng)預(yù)評(píng)估剔除先天差異比較大的個(gè)體，而且樣本量不宜過小，有時(shí)候還需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)先的訓(xùn)練。為保證實(shí)驗(yàn)的客觀性，需要很好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與控制，有時(shí)連晝夜節(jié)律等變化的影響都需要考慮在內(nèi)。行為學(xué)測(cè)試結(jié)果對(duì)嗅覺功能評(píng)估只是一個(gè)綜合的結(jié)果，對(duì)嗅覺障礙程度、部位等的判斷較差，如果能結(jié)合嗅覺誘發(fā)電位等客觀檢查可以做到更加客觀、可信。在過去的實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)測(cè)試往往與組織學(xué)檢查相結(jié)合，既增加了實(shí)驗(yàn)的客觀性，又為進(jìn)一步研究嗅覺產(chǎn)生機(jī)制或嗅覺障礙的原因提供了基礎(chǔ)。

　　2 客觀評(píng)估方法

　　嗅覺的感受、傳導(dǎo)是個(gè)比較復(fù)雜的過程，氣味分子通過鼻腔到達(dá)嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附，進(jìn)而在黏膜層中擴(kuò)散，到達(dá)嗅細(xì)胞。達(dá)到閾濃度的氣味分子可刺激嗅細(xì)胞產(chǎn)生嗅覺電位，這是其感受過程。產(chǎn)生的嗅覺電位通過嗅神經(jīng)穿過篩骨篩板，到達(dá)嗅球，其內(nèi)有第2級(jí)神經(jīng)元，再通過嗅束傳導(dǎo)至初級(jí)嗅皮質(zhì)及皮質(zhì)內(nèi)側(cè)核，而后至海馬回的內(nèi)嗅皮層即次級(jí)嗅皮層，神經(jīng)沖動(dòng)引起大腦皮層的激活才能*后引發(fā)嗅覺。嗅覺功能的客觀評(píng)估方法包括了對(duì)嗅覺感受、傳導(dǎo)通路上各種指標(biāo)，例如影像學(xué)、電生理學(xué)、組織學(xué)等的測(cè)量。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用較多的及可能有較大發(fā)展前景的客觀評(píng)估方法包括以下幾類。

　　2.1 組織學(xué)方法

　　這里的組織學(xué)是泛指解剖取組織后進(jìn)行的所有檢查，包括大體解剖學(xué)、病理學(xué)、**學(xué)、分子生物學(xué)等諸多學(xué)科的檢查方法。嗅覺系統(tǒng)的改變既可以由病變本身引起也可以是因?yàn)樾嵊X障礙后的退行性變引起。組織檢查比結(jié)構(gòu)影像檢查更有評(píng)估價(jià)值，因其可以更好地提示病因，也利于更好地研究嗅覺通路和嗅覺障礙產(chǎn)生的機(jī)制。目前組織學(xué)方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有很廣泛的應(yīng)用，從部位選擇上看整個(gè)嗅覺傳導(dǎo)通路包括從嗅黏膜直到海馬回的內(nèi)嗅皮層都有報(bào)道，從實(shí)驗(yàn)方法上看更是復(fù)雜多樣，*常用的幾種方法有如下幾種。

　　2.1.1 病理學(xué)檢查 這是早期**學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)還不是很發(fā)達(dá)時(shí)常用的檢查手段，在早期嗅覺研究中有較多的應(yīng)用，在嗅覺障礙的動(dòng)物標(biāo)本上可以看到細(xì)胞凋亡、空泡等變化，雖然特異性較差，但是也能提供宏觀的信息，現(xiàn)在常常和其他檢查方法一起使用，例如在陳志宏等的實(shí)驗(yàn)中在進(jìn)行其他檢查之前使用了HE染色方法檢查了模型小鼠的嗅上皮，發(fā)現(xiàn)其嗅上皮變薄，其中的感覺神經(jīng)元的細(xì)胞核層數(shù)變少[9]。

　　2.1.2 蛋白及核酸表達(dá)的檢查 對(duì)相應(yīng)組織中某些標(biāo)志性蛋白及核酸的檢查可以間接地反映嗅覺功能及提示嗅覺障礙的原因。例如用**組化方法檢查嗅覺通路中嗅標(biāo)記蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羥(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、cFos蛋白等標(biāo)記物在許多文獻(xiàn)中都有記載。Buron等[10]在丙酮吸入誘導(dǎo)的嗅覺障礙實(shí)驗(yàn)中使用了嗅上皮組織的OMP及增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)丙酮對(duì)于嗅上皮的損傷是有選擇性的。有學(xué)者使用多巴胺及細(xì)小白蛋白作為標(biāo)記物進(jìn)行**組化檢查，發(fā)現(xiàn)失嗅動(dòng)物模型的嗅球中含多巴胺及細(xì)小白蛋白的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，認(rèn)為通過該失嗅動(dòng)物模型可以對(duì)嗅球萎縮進(jìn)行定量描述，提示多巴胺及細(xì)小白蛋白在嗅球中的表達(dá)對(duì)于失嗅的作用[11]。cFos蛋白可反映大腦組織活動(dòng)程度，對(duì)cFos蛋白的觀察可以一定程度上起到功能磁共振的作用[12]。

　　2.2 電生理學(xué)方法

　　2.2.1 嗅電圖 將電極直接置于嗅區(qū)黏膜，當(dāng)其接受嗅素刺激時(shí)記錄到的一種慢相負(fù)性電位變化稱為嗅電圖，目前普遍認(rèn)為它是單個(gè)嗅細(xì)胞電位變化的總和，嗅電圖已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[13]。嗅電圖*大的缺陷在于雖然其對(duì)嗅黏膜損傷引起的嗅覺障礙有較大的意義，但是對(duì)于黏膜后傳導(dǎo)通路以及嗅球、海馬回等**病變導(dǎo)致的嗅覺障礙沒有什么評(píng)估價(jià)值。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺評(píng)估方法概述

　　2.2.2 嗅覺腦電圖 嗅覺誘發(fā)腦電圖是指在給予嗅刺激時(shí)，實(shí)驗(yàn)對(duì)象的腦電圖可發(fā)生變化，Hirano等[14]用狗做實(shí)驗(yàn)時(shí)成功地獲得了該變化，在他的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腦電圖的快波對(duì)嗅覺功能的意義較大。嗅覺誘發(fā)腦電圖又相繼在大鼠等其他動(dòng)物身上得到了驗(yàn)證[15]。嗅覺腦電圖產(chǎn)生的機(jī)制還不是很明確，而且其特異性不是很高，故目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究、應(yīng)用的較少。

　　2.2.3 嗅覺誘發(fā)電位 又稱為嗅覺事件相關(guān)電位(olfactory eventrelated potentials,OERP)，*早是用電刺激動(dòng)物嗅黏膜時(shí)在頭皮特定部位記錄到穩(wěn)定的腦電位的變化，該方法經(jīng)過一段時(shí)間的發(fā)展后認(rèn)為其和自然嗅覺之間有一定的差距，故逐漸被化學(xué)氣味誘導(dǎo)的嗅覺誘發(fā)電位所取代，目前使用的已經(jīng)比較少。早期化學(xué)氣味刺激除了有嗅覺刺激外還常常伴有物理刺激及對(duì)三叉神經(jīng)的化學(xué)刺激，這些非嗅刺激干擾了正常嗅覺誘發(fā)電位的獲得。隨著僅能興奮嗅覺系統(tǒng)而不興奮三叉神經(jīng)系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)如香草醛等，以及Kobal式嗅覺刺激器的出現(xiàn)，嗅覺誘發(fā)電位研究成為嗅覺研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。嗅覺誘發(fā)電位儀至少包括嗅覺刺激器及腦電采集系統(tǒng)，測(cè)量時(shí)需要在電聲屏蔽室進(jìn)行，且需要給予一定的白噪聲掩蔽刺激探頭釋放刺激時(shí)產(chǎn)生的干擾噪聲。目前動(dòng)物嗅覺誘發(fā)電位各波的具體來源以及與**間的相互關(guān)系還不清楚，嗅覺誘發(fā)電位的出現(xiàn)是否意味著動(dòng)物確實(shí)產(chǎn)生了嗅覺還不能肯定，所以用來證明嗅覺傳導(dǎo)通路是否暢通比較可行[16]，而暫不能用于嗅性**的定位、定性診斷。嗅覺誘發(fā)電位應(yīng)該是*可能成為動(dòng)物嗅覺評(píng)估客觀標(biāo)準(zhǔn)的檢查方法。

　　3 影像學(xué)方法

　　3.1 嗅覺系統(tǒng)結(jié)構(gòu)影像檢查

　　有研究證明嗅球及嗅束等神經(jīng)結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)與周圍神經(jīng)沖動(dòng)的輸入有關(guān)[17]，所以嗅覺障礙后嗅覺系統(tǒng)各部位可有一定的不依賴于年齡的結(jié)構(gòu)改變，通過磁共振影像檢查可以發(fā)現(xiàn)這些改變，例如嗅球體積變小、嗅溝缺失或變淺、嗅束缺失等現(xiàn)象，從而間接評(píng)價(jià)嗅覺功能。

　　3.2 嗅覺系統(tǒng)功能影像檢查

　　這是目前嗅覺研究的熱點(diǎn)方向之一，主要技術(shù)有功能性磁共振成像(fMRI)、PET成像和腦信號(hào)的光學(xué)成像等。

　　3.2.1 功能磁共振檢查 功能磁共振檢查技術(shù)有很多，用于嗅覺系統(tǒng)功能的fMRI技術(shù)主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI)，當(dāng)氧合血紅蛋白的比例增加時(shí)或去氧血紅蛋白含量減少時(shí)，T2信號(hào)縮短效應(yīng)減弱，表現(xiàn)為MR信號(hào)增強(qiáng)。嗅覺功能成像既能反映血流的變化，也能反映神經(jīng)元活動(dòng)的代謝變化，近些年在研究神經(jīng)功能方面發(fā)揮著巨大的作用，特別是fMRI無放射暴露，可反復(fù)測(cè)試，且時(shí)間、空間分辨率要優(yōu)于PET成像，故是目前嗅覺功能成像的主要方法。在大鼠實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，7 T的fMRI能夠顯示氣味刺激后大鼠嗅球的活化[11]。其空間分辨率很高，對(duì)于研究嗅覺相關(guān)皮層的定位、嗅覺功能障礙情況下嗅覺相關(guān)皮層反應(yīng)的變化等有極大的應(yīng)用價(jià)值。有學(xué)者擬通過信息技術(shù)將嚙齒類動(dòng)物嗅球的激活圖像編成二維的氣味圖(OdorMap，OM)及氣味圖數(shù)據(jù)庫(kù)(OdorMap Database，OMDB)以利于嗅覺工作者對(duì)嗅覺系統(tǒng)的研究[18]。功能磁共振應(yīng)用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的嗅覺評(píng)估中需要注意的是：首先動(dòng)物是不能配合磁共振檢查的，故需要在麻醉下進(jìn)行;其次磁共振是強(qiáng)磁場(chǎng)環(huán)境，故嗅覺刺激裝置不能由金屬制成。

　　3.2.2 腦功能光學(xué)成像 腦功能光學(xué)成像是近年來神經(jīng)外科的熱點(diǎn)研究方向，目前主要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有激光散斑襯比成像和內(nèi)源信號(hào)光學(xué)成像。而應(yīng)用于嗅覺功能檢查的主要是內(nèi)源信號(hào)光學(xué)成像，這里所指的內(nèi)源信號(hào)，并不是神經(jīng)元所表現(xiàn)出來的電信號(hào)，而是指由神經(jīng)元活動(dòng)所引起的有關(guān)物質(zhì)組分、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的改變而導(dǎo)致其光學(xué)特性的變化，在與某些特定波長(zhǎng)的光量子相互作用后，得到的包含了這些特性的光信號(hào)，包括：血紅蛋白信號(hào)、氧合血紅蛋白信號(hào)、光散射特征信號(hào)等[1920]。許多生理性過程如血紅蛋白氧合度、細(xì)胞色素的氧合狀態(tài)、神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元腫脹、功能性血流量改變等變化，都會(huì)影響到組織光反射特性的改變。通過探測(cè)反射光的變化量，就可以獲得這種特異性的內(nèi)源光學(xué)信號(hào)。內(nèi)源光學(xué)信號(hào)成像在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已用于多種腦功能皮層功能的檢查，比如視覺(貓、小鼠等)、軀體感覺皮層(大鼠、貓、松鼠猴等)、聽覺皮層(南美栗鼠、貓、雪貂等)。Bathellier等[21]在實(shí)驗(yàn)中使用了內(nèi)源光學(xué)信號(hào)原理和突觸素?zé)晒鈽?biāo)記兩種方法分別獲得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情況，在內(nèi)源光學(xué)信號(hào)成像下，激活的嗅小球反光率下降，呈相對(duì)的冷色調(diào)，而在熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中激活區(qū)域熒光反應(yīng)較強(qiáng)。雖然內(nèi)源光學(xué)信號(hào)成像的時(shí)空分辨率都較高，但是其穿透腦皮層的能力受限(大約數(shù)百微米)，所以對(duì)于深層腦組織的觀察就沒有什么效果了。由于內(nèi)源光學(xué)信號(hào)的確切生理來源至今沒有定論，所以為了闡述內(nèi)源光信號(hào)對(duì)應(yīng)的生理意義及其與神經(jīng)元電活動(dòng)的關(guān)系，還需要與其他方法進(jìn)行對(duì)比研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中嗅覺評(píng)估方法概述

　　從其他感覺的評(píng)估方法來看，功能磁共振和誘發(fā)電位是研究的發(fā)展方向，但目前嗅覺產(chǎn)生、傳導(dǎo)機(jī)制尚未完全明了，相關(guān)檢查技術(shù)尚處于起步階段，還需要進(jìn)行大量的研究。目前的嗅覺研究可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)條件選擇不同的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)方法的組合。嗅覺誘發(fā)電位及功能磁共振檢查由于其初期投入較大，對(duì)硬件及技術(shù)條件要求較高，開展難度較大，在國(guó)內(nèi)只有少數(shù)醫(yī)院在從事這方面的實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)方法操作簡(jiǎn)單，技術(shù)成熟，效果肯定，有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。組織學(xué)方法對(duì)于機(jī)理的研究十分重要，并且隨著對(duì)嗅覺認(rèn)知的加深，越來越多的標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，評(píng)估方法也越來越豐富。如果可以出現(xiàn)一種簡(jiǎn)單易行的嗅覺評(píng)估方法，那么可以極大地促進(jìn)嗅覺的研究。