【摘要】 目的觀察β-淀粉樣蛋白1-40（Aβ1-40）大鼠海馬雙側注射后大腦組織Caspase-3表達和海馬神經細胞超微結構的變化及加減地黃飲子的干預作用。方法采用大鼠海馬立體定向注射凝聚態Aβ1-40誘導阿爾茨海默?。ˋD）動物模型。采用**印跡方法檢測大腦組織Caspase-3的表達，通過透射電子顯微鏡觀察海馬組織神經細胞超微結構的變化。結果模型組大鼠大腦組織Caspase-3蛋白表達相對值（2.647±0.603 6）較假手術組（0.901±0.102）明顯升高（P＜0.05），而加減地黃飲子(1.331±0.105 3)可下調Caspase-3的表達（P＜0.05）。Aβ1-40可致模型組大鼠海馬神經元的胞體質膜下出現大量的脂褐素，游離核蛋白體減少，加減地黃飲子對損傷有不同程度的恢復。結論加減地黃飲子通過上調Caspase-3蛋白的表達而發揮保護Aβ對大鼠腦神經細胞的損傷。
【關鍵詞】 阿爾茨海默??；加減地黃飲子；Caspase-3
【Abstract】 Objective To observe the effects of modified decoction of Rehmanniae on expression of caspase-3 protein and ultrastructural changes of pyramidal neurons in hippocampal in Alzheimer′s disease (AD) rats induced by amyloid-β1-40 injection into brain.Methods AD model rats were induced by amyloid-β1-40 sterotaxis injection.Modified decoction of Rehmanniae was given by oral administration for 28 days.Expression of caspase-3 protein in rat brain was estimated by Western blotting method.Ultrastructure of pyramidal neurons in hippocampal was observed by transmission electron microscope.Results The expression of caspase-3 in model group (2.647±0.603 6) was significantly higher than that in sham group(0.901±0.102) （P＜0.05）,and that in the modified decoction of Rehmanniae group (1.331±0.105 3) was significantly lower than that in model group （P＜0.05）.Lipofuscin deposit in hippocampal neurons in model group and the cell apparatus numbers decreased.Modified decoction of Rehmanniae treatment had protective effects on the neuronal cells damnification.Conclusions Modified decoction of Rehmanniae protect brain neurons from being injuried by Aβ1-40 by up-regulating the expression of caspase-3 protein.
【Key words】 Alzheimer′s disease；Modified decoction of Rehmanniae；Caspase-3
阿爾茨海默?。ˋD）是一種以進行性認知障礙和記憶能力損傷為主的**神經系統退行性變性**，目前認為AD患者記憶力減退和認知功能障礙的主要相關病理現象是神經元丟失〔1〕，有研究提示，神經細胞過度凋亡是神經元丟失的主要原因，體外研究發現AD的核心成分β-淀粉樣蛋白(Aβ)能誘導神經元的凋亡〔2〕。Caspase家族激活是大多數細胞凋亡的共同途徑，并且其抑制劑可阻斷Aβ誘導的神經元凋亡，提示Caspase在AD神經元退變中起重要作用〔3〕。為此，我們采用海馬立體定向注射技術將Aβ1-40注入大鼠雙側海馬誘導AD模型，并觀察加減地黃飲子提取物對AD模型大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達和海馬超微結構的干預作用，揭示中藥提取物對Aβ誘導的神經元凋亡的保護作用及機制。
1 材料與方法
1.1 實驗** 加減地黃飲子提取物：肉蓯蓉、麥冬、人參、遠志、五味子和山茱萸等用8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次2 h；生姜、薄荷和石菖蒲加10倍量水6 h提取揮發油；方中熟地、茯苓、巴戟天、石斛、大棗與醇提取后的藥渣及揮發油提取后藥渣一同加16倍的水，回流提取3次，每次1 h；醇提取濃縮液和水提取濃縮液混合，血竭等原粉加入，干燥得干膏，干膏粉碎成細粉，加入揮發油。實驗用不含賦形劑的浸膏。鹽酸多奈哌齊片由法國PFIZER PGM公司制造，產品批號5136903。Aβ1-40為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。Aβ1-40使用前用無菌生理鹽水稀釋成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變為聚集狀態的Aβ。
1.2 實驗動物 選用健康雄性清潔級SD大鼠100只，鼠齡8～12 w，體重(280±10) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號SCXK（京）2002-0003。經適應性飼養1 w，隨機分為空白對照組、假手術組、模型組、鹽酸多奈哌齊組和加減地黃飲子組共5組。
1.3 試劑蛋白提取試劑盒Ⅰ（北京天來生物醫學科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京賽馳生物科技有限公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（美國Jackson Immunoresearch Laboratories公司）；Caspase-3（H-277）(德國Santa Cruz公司) ；Western blotting luminol reagent（德國Santa Cruz公司）；藍色預染低分子量蛋白質Marker（14.4～97.4 kD）（Solarbio公司）；考馬斯蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其余均為分析純試劑。
1.4 儀器 JY-ZY2型轉移電泳槽、JY-CZ1型單垂直電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)；江灣Ⅰ型C立體定向器（**軍醫大學）；EM208S透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）；morris水迷宮分析系統可以由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號：XR-XM101。
1.5 方法
1.5.1 制?！?〕 實驗大鼠經腹腔注射1%****鈉（40 mg/kg）麻醉后，立體定向器耳桿固定頭部。顱頂區備皮**后作2 cm切口，分離骨膜使頭骨暴露。于前囟向后3.0 mm，在分別向中線左和右各旁開2.2 mm處，用牙科鉆打開顱骨。垂直進微量進樣器針2.8 mm，將1 μl溶液在5 min緩慢注入，并留針5 min使溶液充分彌散。模型組、鹽酸多奈哌齊組、加減地黃飲子組左右側海馬各注射1 μl Aβ1-40溶液，假手術組注射1 μl生理鹽水后**并縫合切口皮膚。
1.5.2 給**法 造模后3 d開始給藥，根據人和動物按體表面積折算的等效劑量。鹽酸多奈哌齊組按0.33 mg·kg-1·d-1，加減地黃飲子組按1.0 g·kg-1·d-1給藥，1次/d灌胃。其余3組給等體積生理鹽水，共4 w。
1.5.3 Western印跡檢測Caspase-3蛋白表達采用蛋白提取試劑盒Ⅰ提取蛋白質。每組大鼠各取4只，Morris水迷宮測試（另文報道）完后迅速取腦，將100 mg腦組織剪碎后加入0.5 ml裂解液勻漿，加1 ml抽提試劑室溫靜置10 min，于4℃ 10 000 r/min離心10 min，棄去液體后室溫干燥沉淀。將提取蛋白加200 μl上樣緩沖液，煮沸10 min，室溫放置20 min溶解沉淀，置-80℃保存備用。用BCA法檢測樣品蛋白質濃度后，取50 μg蛋白質加入2×SDS凝膠加樣緩沖液中，置水浴煮沸5 min使蛋白質變性，然后將樣品經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h分離。膠中蛋白質在70 mA恒流狀態下4℃過夜電泳轉移至硝酸纖維素膜。膜在5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。將兔抗大鼠Caspase-3（1∶500）與硝酸纖維素膜4℃培育過夜。與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）37℃溫預1 h。用Western印跡熒光發光檢測試劑盒發光、壓片。以上反應均在塑料袋內進行，其間用TTBS充分洗滌。Western印跡檢測結果采用AlphaImagerTM 圖像分析系統掃描，利用AlphaEaseFC軟件測定積分光密度值。在Western印跡分析中，以空白對照組Caspase-3雜交帶的積分光密度值為相對值，其他各組雜交帶的積分光密度值均與空白對照組雜交帶的積分光密度值比，得出相對值。以相對值來半定量分析各組的表達量，以避免不同批次雜交形成的條件差異，顯色長短不一產生的誤差。
1.5.4 海馬錐體細胞超微結構的觀察每組大鼠各取3只，Morris水迷宮測試完后立即斷頭處死，剪開頭皮，暴露顱骨，由枕骨大孔處迅速剪開顱骨，剝離腦組織，游離海馬，在含2.5%預冷的戊二醛溶液中，將海馬切成1 mm厚左右的橫斷薄片，30 min后再次在固定液中切取小于2 mm的海馬區小組織塊，繼續固定2 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗后1%鋨酸后固定2 h。梯度乙醇和丙酮混合液脫水至100%丙酮，在此期間同時用溶于70%乙醇的醋酸雙氧鈾進行塊染。置于環氧樹脂包埋液滲透24 h；以環氧樹脂全包埋液包埋后，63℃聚合72 h；半薄切片定位海馬錐體細胞層后進行修快，超薄切片，枸櫞酸鉛和雙氧鈾染色后上透射電子顯微鏡觀察并拍照。
1.6 統計學方法計量資料以x±s表示，運用SPSS13.0軟件，組間差異采用單因素方差分析,進一步post-hoc分析采用SNK檢驗。
2 結果
中藥提取物對阿爾茨海默病模型大鼠神經細胞凋亡的干預
2.1 加減地黃飲子對AD大鼠海馬錐體細胞超微結構的影響電鏡下，模型組和假手術組大鼠海馬錐體細胞超微結構基本正常，模型組大鼠海馬神經元的胞體質膜下出現大量的脂褐素，游離核蛋白體減少。鹽酸多奈哌齊組和加減地黃飲子組胞質內脂褐素和尼氏體較多。突觸小泡數量明顯增多，錐體細胞的損傷有不同程度的恢復（圖1）。
2.2 加減地黃飲子對AD大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達的影響模型組海馬組織勻漿中Caspase-3表達相對值（2.646±0.604）較假手術組（0.901±0.102）明顯升高（P＜0.05）。加減地黃飲子組海馬勻漿中Caspase-3表達相對值（1.331±0.105）較模型組降低（P＜0.05），加減地黃飲子組海馬勻漿中Caspase-3表達相對值較鹽酸多奈哌齊組（1.804±0.280）低（P＜0.05）（圖2）。
圖1 海馬神經細胞超微結構改變（略）
圖2 大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達（略）
3 討論
AD主要病理特征有老年斑、神經元纖維纏結和神經元丟失，細胞凋亡是AD神經細胞死亡的一條重要途徑〔5〕。Aβ對神經元存在直接毒性作用，在體內體外均可引起神經細胞凋亡，它的異常代謝被認為是AD各種病理改變的共同通路。目前，抗神經細胞凋亡已成為**AD的靶點之一。細胞凋亡是一系列蛋白酶活化后產生的級聯反應，Caspases是一類調節凋亡的半胱氨酸蛋白水解酶，活化后是凋亡過程中水解特異性底物的關鍵效應器〔6〕。雖然在細胞凋亡中存在著不同的死亡信號轉導途徑，Caspase-3則可能是細胞凋亡下游的關鍵執行者，它的激活是刺激特異性反應導致神經元丟失的重要機制〔7〕。
目前化學****AD收效頗微，相形之下，中藥多組分、多靶點和協同作用的特點使其更適合防治AD。地黃飲子原方出自劉完素《黃帝素問宣明論方》，用于**喑痱證。結合諸多醫家臨床應用體會，我們提出**化痰**開竅法并將古方地黃飲子予以化裁用于AD的**，并在臨床上取得了一定療效。研究發現，加減地黃飲子能改善AD大鼠學習記憶能力〔4〕，本實驗通過立體定向海馬部位注射Aβ1-40的方法，誘導AD大鼠模型，以加減地黃飲子進行**干預，從凋亡相關基因Caspase-3 蛋白表達和海馬錐體細胞超微結構改變方面觀察了其對Aβ誘導的實驗性AD模型大鼠的影響。結果顯示，模型組腦組織Caspase-3表達相對值較假手術組升高，加減地黃飲子組腦組織Caspase-3表達相對值較模型組降低（P＜0.05）；加減地黃飲子組腦組織Caspase-3表達相對值較鹽酸多奈哌齊組降低（P＜0.05）。表明Aβ1-40海馬注射促進Caspase-3蛋白表達，而加減地黃飲子對其表達則有抑制作用。通過超微結構的觀察也發現加減地黃飲子對錐體細胞的損傷有不同程度的恢復作用。表明加減地黃飲子抑制Aβ誘導的細胞凋亡，從而減少了神經元的丟失，對AD發揮**作用。中藥提取物對阿爾茨海默病模型大鼠神經細胞凋亡的干預
