一、實驗目的

（1）本實驗通過進行穿梭，跳臺，避暗，高架十字迷宮，曠場，懸尾，強迫游泳等實驗來研究松樹皮提取物在改善學習記憶，抗焦慮，抗抑郁等方面的功效。

（2）研究松樹皮提取物對小鼠行為學方面的影響，為松樹皮提取物的進一步研究和應用提供實驗依據實驗材料。

二、實驗材料 

動物：  ICR 小鼠40只，重量( 20±2) g

     儀器：  小鼠行為學儀器（穿梭儀，避暗儀，高架十字迷宮（型號XR-XG201），懸尾強迫實驗裝置等），儀器品牌：Xmaze。

三、實驗方法

    3.1松樹皮提取物對小鼠學習記憶的影響

3.1.1穿梭實驗

取40只健康小鼠，雌雄各半，隨機分為4組，即空白對照組，松樹皮高，中，低劑量組，每組10只，分別灌胃給藥，空白對照組灌胃給與生理鹽水。連續給藥15天，與第11天開始穿梭實驗。穿梭箱為一封閉的長方形盒子30cm×10cm×20cm，頂部有蜂鳴器 ，底部平行排列銅柵 ，間隔 0.5cm，銅柵可以通電。設定電刺激(1mA)時間15s ，蜂鳴 5s ，間隔 15s。訓練時先將小鼠放入穿梭箱適應 3min，然后給予電刺激 ，小鼠受到電刺激后逃到另一端 ，蜂鳴及電刺激立即停止。每日訓練1次 ，每次20個循環 ，共訓練4天。第15天測驗時，將小鼠放入穿梭箱一端，給予蜂鳴 5s ，然后通電 (1mA) ，間隔15s ，每次20個循環。記錄小鼠電刺激成功逃避次數，逃避反應平均時間。

3.1.2 避暗實驗  松樹皮提取物對小鼠行為學的影響

以上實驗結束后，動物休息兩天但保持連續給藥，于16次給藥后1h進行避暗實驗。實驗裝置分為明暗兩室，兩室之間有一直徑為3 cm的圓洞，暗室底部銅柵通電。訓練時先將小鼠放入反應箱中適應5 min，然后暗室底部銅柵通以40 V、50 Hz 交流電，將小鼠背對洞口放入明室，小鼠進入暗室即受電擊，記錄5 min內進入次數(錯誤次數)，作為訓練成績。第17天給藥后再次將小鼠放入明室，記錄潛伏期和5 min內進入次數(錯誤次數)。 如果5 min時小鼠仍未進入暗室，錯誤次數記為0次，潛伏期記為300 s。(訓練時第1次進入暗室的時間(潛伏期)大于180 s者棄去不用)

3.2松樹皮提取物對小鼠焦慮行為的影響

3.2.1 高架十字迷宮實驗

        以上實驗結束后，動物休息兩天但保持連續給藥，于第21次給藥后1小時進行實驗。小鼠高架十字迷宮由 2 個開臂（長×寬：30cm×5 cm）和 2個閉臂（長×寬×高：30 cm×5 cm×15 cm） 組成，1個連接4只臂的中央平臺（5 cm×5 cm），開放臂與封閉臂二者互相垂直成十字狀。在迷宮正上方安裝好攝像機，調整好影像畫面，將4臂與中央平臺劃分為5個區域。將小鼠置于十字迷宮的中央平臺，使其頭部正對其中一個開放臂，開始計時，用動物行為活動記錄分析系統記錄并分析小鼠在迷宮內 5 min 的探究行為，包括小鼠進入 2 個閉臂的次數，進入2個開臂的次數，在開臂的活動時間，進入開臂次數的百分比等。每實驗完1只小鼠，用75％酒精擦洗迷宮并揮干，再進行下一只小鼠的實驗。

3.2.2 曠場實驗

         以上實驗結束后，動物休息兩天但保持連續給藥，于24次給藥后1小時進行實驗。曠場箱是一個單邊長為 27.5 cm、 總邊長為110 cm的正方形，在圖形上將該正方形區分為周邊、中央兩個區域。中央區為套在大正方形中的一個單邊長為13.75 cm、總邊長為55 cm的小正方形，此小正方形到大正方形各邊的距離相等。小正方形與大正方形之間的區域即為周邊區。在曠場箱正上方安裝好攝像機，調整好影像畫面。將小鼠置于曠場箱的中央，開始計時，用動物行為活動記錄分析系統記錄并分析小鼠在曠場箱內 5 min 的自主探究行為，包括小鼠進入中央格的次數，在中央格的活動時間，進入外周格的次數，在外周格的活動時間等。每實驗完1只小鼠，用75％酒精擦洗曠場箱并揮干，再進行下一只小鼠的實驗。

3.3松樹皮提取物對小鼠抑郁行為的影響

3.3.1 懸尾實驗

       以上實驗結束后，動物休息兩天但保持連續給藥，于第26次給藥1 h 后進行懸尾實驗，距小鼠尾尖部約1 cm 處用橡皮膏貼于絲線的一端，將之固定于水平放置的棒狀物上，中間用板隔開，防止彼此看到對方，小鼠頭部離臺面約5 cm，室溫18 ℃保持恒定，小鼠懸掛2 min 后，立即開始觀察，觀察持續4 min，記錄4 min 內小鼠的不動( 小鼠在空中停止掙扎，或僅有細小的肢體運動) 時間。

3.3.2強迫游泳實驗

以上實驗結束后，動物休息兩天但保持連續給藥，于第28次給藥1 h 后，將小鼠放入高20 cm、直徑14 cm的圓柱型玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10 cm，水溫( 25±1) ℃。小鼠游泳2 min 后， 立即開始觀察，觀察持續4 min， 記錄4 min 內的小鼠不動的時間( 小鼠在水中停止掙扎， 或動物呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動)。

四、實驗結果

4.1松樹皮提取物對小鼠學習記憶的影    松樹皮提取物對小鼠行為學的影響

結果見下表：

表4.1.1 松樹皮提取物對小鼠穿梭實驗的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

表4.1.2 松樹皮提取物對小鼠避暗實驗的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

從以上數據可以看出，**組和空白組在穿梭試驗和避暗實驗中的檢測指標均未出現顯著性差異，這表明松樹皮提取物可能對小鼠的學習記憶行為影響不大。

4.2松樹皮提取物對小鼠焦慮行為的影響

結果見下表

表4.2.1 松樹皮提取物對高架十字迷宮實驗的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

表4.2.2 松樹皮提取物對小鼠曠場實驗的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

在高架十字迷宮實驗中，松樹皮提取物中劑量組在開臂停留時間百分率要明顯高于空白對照組，且有顯著的統計學意義。但在曠場實驗中，在中央格的次數并未增加，所以松樹皮提取物對小鼠的焦慮行為影響，可能需要進行更加精密的實驗進行驗證。

結果見下表

表4.3 松樹皮提取物對小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

從上表可以看出，在懸尾實驗中，松樹皮提取物低劑量能顯著降低小鼠的不動時間，提示可能有抗焦慮作用。但在強迫游泳試驗中，雖然松樹皮提取物低劑量組不動時間減少，但并沒有統計學意義，可能是個體差異造成。這提示我們設計更加精密的抗抑郁實驗能更好的檢測其作用。

五、實驗討論

      穿梭和避暗實驗能夠評價動物主動回避和被動回避外界環境刺激的能力。高架十字迷宮實驗和曠場實驗，利用動物對新異環境的恐懼心理和探究特性形成的矛盾沖突來考察動物的焦慮水平。懸尾實驗模型和強迫游泳實驗模型不動時間是衡量動物行為改變的主要指標，既能反映造模成功與否，又可作為絕望動物行為的指標。以上實驗在成功造模的基礎上可以很好的探究**對學習記憶，焦慮，抑郁行為的影響。

      高架十字迷宮實驗中，將動物置于迷宮的中央區，在一定時間內觀察動物分別進入開臂和閉臂的時間與次數。由于開臂和外界相通，動物在好奇探究的同時也會產生焦慮反應。若焦慮水平高，則動物會離開開臂，反之則在開臂停留的時間長，對開臂的探究次數也增多。實驗結果顯示松樹皮提取物中劑量組在開臂的停留時間明顯延長，提示可能有抗焦慮的作用。懸尾實驗中，動物的抑郁程度高，則不動時間長，不動時間短，活動時間長，則說說明抑郁程度低。從實驗結果可以看出，松樹皮提取物低劑量組，懸尾實驗中不動時間明顯低于空白對照組，提示松樹皮提取物可能有抗抑郁的作用。

      本實驗只是初步探究實驗，得出的結果是為以后更加精密的實驗做鋪墊。