脾虛對大鼠學習記憶影響的研究
材料與方法
1． 實驗動物：
選取清潔級12周齡Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重180±20g，由中山醫科大學實驗動物中心提供，合格證（檢證字）2001A038號，（中山醫動字）2002053號。動物飼養于福建中醫學院實驗動物中心，醫學實驗動物環境設施合格證書醫動字第23-016號，動物分籠飼養，自由飲水，飼料由福建中醫學院實驗動物中心提供標準顆粒飼料。
2． 實驗藥品：
實驗所需中藥材向福建省藥材公司購買道地藥材，實驗所需試劑雙縮脲蛋白定量測試盒、NO測試盒、NOS測試盒及一些配用試劑由福建中醫學院中心實驗室向南京建成生物研究所代為購買或提供，試劑盒批號20021010。
3． **配制：
（1）造模** 小承氣湯由厚樸、枳實、大黃組成。質量比按3：3：2配備，先經蒸餾水浸泡2h，按常法煎煮2次，每次煮沸后煎煮20min過濾，合并濾液，70-80℃水浴濃縮為2g/ml藥液，冰箱儲存備用。
（2）**** 四君子湯由人參、白術、茯苓、炙甘草組成。質量比按2：2：2：1配備，先經蒸餾水浸泡2h，按常法煎煮2次，每次40min過濾，合并濾液，70-80℃水浴濃縮為2g/ml藥液，冰箱儲存備用。
以上實驗用湯劑由福建中醫學院屏山制藥廠加工制成所需制劑。
4． 儀器設備：
RF—540熒光分光光度計 上海
721分光光度計 上海
BACMON高速冷凍離心機 中國
恒溫水浴箱 中國
SAYAN超低溫冰箱 日本
上海欣軟信息科技有限公司提供上等的morris水迷宮視頻分析系統。
5． 造模方法：
參照傅湘琦等依據中醫耗氣破氣和飲食失節的理論塑造大鼠脾虛模型的方法[43]，稍加以改進。造模組隔日給藥，上、下午各一次，每次2毫升，給藥后**日禁食，自由飲水，造模時間為6周。
6． 分組與施加因素：
（1）分組 動物適養三天后，大鼠隨機分成2大組，正常組A組、模型組B組，正常組20只，模型組60只，正常組又分為A1、A2 2小組，分別用來與生化測定各組和行為測定各組進行比較；模型組分為脾虛組B1、C1、脾虛**組B2、C2和脾虛自由恢復組B3、C3 6小組，每小組各10只，雌雄各半。其中A1、B1、B2、B3 4組用來測定生化指標，A2、C1、C2、C3 4組用來測定行為學指標。
（2）施加因素 首先對模型組B組造模，造模時A組予等量生理鹽水。造模成功后， A1、B1進行各項生化指標測定， A2、C1進行水迷宮實驗；B2、C2組灌服四君子湯，每天上、下午各1次，每次2ml，連續10天， B3 、C3予等量生理鹽水，大鼠服藥劑量按《中藥藥理研究方法學》[44]所提供的“實驗動物與人按體表面積等效劑量換算比率表”倍數折算。10天后B2、B3進行各項生化指標測定，C2、C3進行水迷宮實驗。
7． 標本的采集與制備：
大鼠給藥結束后，斷頭處死，快速取腦，稱濕重，于冰盤上迅速剝離表面漿膜及血管，取左側大腦皮層固定部位1.0×1.0cm組織，稱重,以冷生理鹽水作勻漿介質，研磨制成10%的腦勻漿液，離心取清，冰箱儲存待測。
8． 生化指標的觀測及方法：
（1）標本蛋白含量測定 采用雙縮脲法測定標本蛋白定量，凡分子中含有兩個氨基甲酰基（-CONH2）的化合物能與堿性酮溶液作用，形成紫色復合物，稱為雙縮脲反應，蛋白分子中有許多肽鍵（-CONH-）都能起此反應，各種蛋白顯色程度基本相同。具體操作參照試劑盒說明書。
（2）腦組織NO含量測定 應用改良的Griess法[45]，通過測定NO代謝產物亞硝酸鹽(NO2-)和硝酸鹽(NO3-)的濃度作為衡量NO含量的指標。具體操作參照NO試劑盒說明書。
（3）腦組織NOS活性測定 在有氧和輔助因子的情況下，NOS催化L-精氨酸生成L-狐氨酸和NO。由于氧合血紅蛋白可與NO迅速而不可逆地生成高鐵血紅蛋白(mG)。因而，通過分光光度法(雙波長法)檢測形成的mG，可反映由NOS催化生成的NO量，從而間接測定NOS的活性。具體操作參照NOS試劑盒說明書，分別測出總的NOS和cNOS、iNOS活性。
以上各項生化指標的測試均由專業人員進行測試，測定結果均以換算后的測定值與其相應蛋白含量的比值表示。
9． Morris水迷宮實驗 脾虛對大鼠學習記憶影響的實驗研究
（1） 定位航行試驗(place navigation) 試驗開始先將大鼠放入水池中(不放平臺)自由游泳2分鐘，使其熟悉迷宮環境。試驗共歷時5天，每天定于固定時間段(blocks)，每個時間段訓練4次。訓練開始時，將平臺置于NW象限，從池壁四個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統記錄大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)和游泳路徑，4次訓練即將大鼠分別從四個不同的起始點（不同象限）放入水中。大鼠找到平臺后或120秒內找不到平臺(潛伏期記為120秒)，則由實驗者將其拿上平臺，在平臺上休息15秒，再進行下一次試驗。每日以大鼠四次訓練潛伏期的平均值做為大鼠當日的學習成績。
（2） 空間探索試驗(spatial probe) 第6天撤除原平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，所有大鼠必須為同一入水點，記錄大鼠在2min內跨越原平臺的次數。
10．統計學處理：
結果均采用SPSS10.0統計軟件分析，所用數據用平均數±標準差（x1±s）表示，各組間比較用t檢驗。
實驗結果
1． 各組造模及給藥前后一般情況觀察
正常對照組及其余各組造模前動物精神好，動作靈活，毛發白而有光澤，皮膚粘膜紅潤，飲食量、飲水量多，體重呈直線上升；造模后模型各組動物精神萎糜，乏力、倦怠、閉目、喜扎堆、納食減少，體重逐漸下降或持平，皮毛疏松、粗糙無光澤，且顏色發黃、易脫落、足蹼、鼻尖、耳緣粘膜出現蒼白，**周圍充血、濕潤，造模一周后出現稀便，三周后個別動物因極度衰弱死亡（C3組死亡1只）。**組動物隨著中藥**，飲食逐漸恢復，動物功能低下的表現逐漸改善，皮毛變得舒展，粘膜逐漸紅潤、體重也逐漸增加，至給藥結束時基本恢復正常，與正常對照組比較無明顯異常；自然恢復組動物停止造模條件后，—般表現均不同程度改善，但較中藥**組恢復明顯緩慢。脾虛對大鼠學習記憶影響的實驗研究
2.正常組與脾虛組大鼠腦組織中NO含量和NOS活性比較
表1：正常組與脾虛組大鼠腦組織中NO含量和NOS活性比較（x1±s）
組別 n NO NOS（U/mgprot）
（μmol/gprot） 總NOS cNOS iNOS
正常組A1 10 1.91±0.53 146.06±41.90 115.96±41.56 30.10±3.55
脾虛組B1 10 0.99±0.431） 62.95±21.771） 45.72±23.031） 17.23±5.631）
注：與正常組比較，1）P<0.01
表2：大鼠腦組織中NO含量和NOS活性比較（x1±s）
組別 n NO NOS（U/mgprot）
（μmol/gprot） 總NOS cNOS iNOS
脾虛組**組B2 10 1.80±0.30 121.43±27.79 94.33±28.47 27.10±5.93
脾虛組自由恢復組B3 10 1.25±0.292） 81.05±21.182） 62.70±17.312） 18.35±4.681）
注：與**組比較，1）P<0.05、1）P<0.01
從表中可看出：正常組與脾虛組比較，脾虛組NO含量、NOS活性明顯較正常組低，差異顯著 (P<0.01) ，見表1；脾虛**組與脾虛自由恢復組比較，脾虛自由恢復組NO含量、NOS活性明顯較正常組低，差異顯著 (P<0.01) ，見表2。
3.各組大鼠水迷宮實驗結果
實驗中正常組與脾虛組比較，正常組大鼠在MWM中定位平臺的學習獲得過程較快，脾虛組尋找平臺的潛伏期明顯延長，學習獲得比較慢，有的大鼠甚至到訓練結束還未學會尋找平臺，二組之間差異顯著。統計結果見表3；脾虛**組與脾虛自由恢復組比較，脾虛**組在MWM中定位平臺的學習獲得過程較快，脾虛自由恢復組學習獲得較慢，二組之間差異顯著，統計結果見表4。脾虛對大鼠學習記憶影響的實驗研究
表3 正常組與脾虛組大鼠潛伏期變化及跨臺次數比較（x1±s）
組別 n 潛伏期（s） 跨臺次數（次）
**天 **天 第三天 第四天 第五天
正常組A2 10 48.99±19.24 35.42±9.501) 21.07±12.321) 20.50±12.371) 14.24±4.101) 7.50±2.551)
脾虛組C1 10 53.24±19.23 49.48±12.87 45.28±10.51 38.92±8.07 35.93±7.57 4.30±1.25
注：與正常組比較，1）P<0.01
表4 脾虛**組與脾虛自由恢復組大鼠潛伏期變化及跨臺次數比較（x1±s）
組別 n 潛伏期（s） 跨臺次數（次）
**天 **天 第三天 第四天 第五天
脾虛**組C2 10 59.88±20.23 39.36±14.63 27.71±8.86 18.61±12.35 15.89±9.63 7.20±1.99
脾虛自由恢復組C3 9 47.20±20.69 40.88±14.08 38.22±10.201) 35.98±9.082) 31.48±7.292) 5.10±1.791)
注：與脾虛**組比較， 1）P<0.05、2）P<0.01
在定位航行試驗中，4組大鼠在歷時5d的水迷宮訓練中，潛伏期結果的動態變化見圖1。各組大鼠在訓練第1天中，絕大多數不能在規定的120s內找到平臺，不少大鼠穿過了平臺但不知停留或站立。從第2天開始陸續有大鼠能自由尋找到平臺逃避，隨著訓練天數增加，逃避潛伏期不斷縮短，統計學分析除正常組與脾虛組有差異外，其余各組大鼠的逃避潛伏期差異無顯著性(P>0.05)。從第3天起各組大鼠潛伏期拉開距離，4組大鼠找到平臺所需時間分別為45s、38s、28s和21s，脾虛組與正常對照組、脾虛自由恢復組與脾虛**組差異顯著(P<0.01)。在后兩天的訓練中各組大鼠成績逐漸趨于穩定。脾虛組有部分大鼠直到訓練結束還未學會尋找平臺。
脾虛對大鼠學習記憶影響的實驗研究
